转化率的计算讲课讲稿

转化率的计算（一）转化（transformation）（1）热激法（heatshock）（2）电转化法（electronporation）（3）PEG介导的原生质体转化（4）接合转化一、重组DNA导入大肠杆菌的方法

1、化学转化法感受态：细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态(competence).

感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合。

这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的。对于大肠杆菌细胞，一般采用CaCl2溶液来处理受体细胞，增加细胞膜的通透性，制备感受态细胞。一、重组DNA导入大肠杆菌的方法一、重组DNA导入大肠杆菌的方法细菌感受态细胞的制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬一、重组DNA导入大肠杆菌的方法重组体导入受体细胞10ng载体DNA100L感受态菌

Onice混合，静置30分钟37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA加入1mLLB培养基42ºC1.5分钟热休克法简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。一、重组DNA导入大肠杆菌的方法平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜一、重组DNA导入大肠杆菌的方法

2.电击转化法

将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。

在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内

原理:

用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞.转化效率高（高于109/gDNA）一、重组DNA导入大肠杆菌的方法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成

50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-400

0.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37℃中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化电击转化法（二）转导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程（三）转染噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。与转化无本质区别体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。每gDNA能形成106个噬菌斑

现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染

体外包装过程二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞原生质体转化碱金属离子介导的完整细胞转化PEG1000转化法电击法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞1.利用原生质体进行转化

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2

PEG插入外源基因的载体转化转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%

酵母0.1mol/LLiCl处理感受态2.碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体40%PEG4000热激涂布选择性平板，筛选转化子

吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转化率：103个

/gDNA；共转化现象极少4.电击转化（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个/gDNA（3）单链转化率高于双链3.PEG1000转化PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞载体介导的转化（农杆菌介导）DNA直接导入（基因抢法、电击法等）种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法通过农杆菌侵染植物外植体（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株在饲养平皿的滤纸上培养2天叶盘法的具体操作又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。DNA1.2m钨弹头吸附金属微粒加速，进入受体细胞基因枪装入2.基因枪法（genegun）

外植体制备轰击外植体培养及选择基因枪具体操作1.DNA微弹的制备2.外植体的制备3.DNA微弹轰击4.外植体的培养植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液电击处理愈伤组织幼苗分化3.电击法（电穿孔法）选择培养二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞1.磷酸钙沉淀法2.脂质体介导法3.显微注射法4.DEAE-葡萄糖转染法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞原理：（三）导入动物细胞1.磷酸钙沉淀法通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。2.脂质体介导法脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。脂质体（lipofectin）载体法应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.显微注射法1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段2）收集受精卵：受孕后几小时内3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植显微注射法(microinjection)二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖转染法葡聚糖葡聚糖DEAE-dextran外源DNA细胞混合DEAE-dextran对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。4.DEAE-葡萄糖转染法导入外源DNA的几种方法三、转化率及影响因素转化率（cfu

/μgDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。（一）转化率的计算：转化率＝产生菌落的总数/DNA的加入量三、转化率及影响因素例：取1μl（0.1ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？转化率＝1000

/0.01ngDNA=108cfu/μg三、转化率及影响因素例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107cfu/mg天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？104＝107cfu/mg×10-2×a×20%重组载体a=0.5mg三、转化率及影响因素普通的亚克隆实验：1×106cfu/μgDNA；更复杂的亚克隆：1×107cfu/μgDNA，如有限量的DNA的转化，T-A克隆；构建文库：>1×108cfu/μgDNA。1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度2）受体细胞3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率（二）转化率的影响因素三、转化率及影响因素

影响转化率的因素

（2）感受态细胞（competen