基因工程课件2-实验1：质粒DNA的小量制备

基因工程实验技术

实验一质粒DNA的小量制备实验目的要求：1、掌握用碱裂解法小量制备质粒DNA2、了解制备原理及各种试剂的作用一、背景知识（载体及质粒）二、实验原理（碱裂解法）三、实验材料四、实验步骤五、预期结果六、注意事项一、背景知识——载体及质粒1、载体功能：为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。为目的基因提供在受体细胞中扩增和表达能力。2、载体种类质粒、噬菌体、腺病毒载体、逆转录病毒载体……3、理想载体的基本条件可转移性合适的复制位点多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA4、质粒（1）特点：存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。举例：pMD-18T质粒宿主细胞

ori抗Amp宿主细菌含Amp培养基多种酶切口多克隆位点限制性内切酶单一酶切口多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体PMD-18T质粒的物理图谱二、碱裂解法小量制备质粒DNA原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

碱裂解法提取质粒主要包括三个部分：（1）裂解细胞加入碱性SDS，破壁与膜，处理的同时也能去除细胞碎片、染色体DNA等杂质。碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。（2）分离当溶液的pH值调节到大于12时，双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅部分氢键被破坏，只是部分双链解离成单链。再将溶液的pH值调回中性时，单链DNA互相缠绕并且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍然是小分子，通过离心很容易将两者分开。达到分离的目的。（3）纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外，还有各种细胞壁、膜的碎片、各种酶与其他蛋白质、脂质类杂质以及RNA等。离心去除各种细胞碎片；用酚处理去除蛋白质，包括各种酶；用RNA酶处理去除RNA等。氯仿有强烈的溶脂性，可去除脂质类杂质。氯仿能将微量的溶于DNA水溶液中的酚抽提掉。异戊醇减少泡沫，使分层明显无水乙醇沉淀法去除水溶液中的痕量酚、氯仿等。沉淀DNA时加入盐类的目的是中和链上的电荷，使DNA易于形成沉淀。70%乙醇进行洗涤DNA沉淀，去除盐类等溶于水的物质。溶液I、II和III的作用：溶液I：由葡萄糖、EDTA、Tris•Cl组成。葡萄糖——增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA；EDTA——络合掉Mg2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用；Tris•Cl——能使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。溶液II：由SDS与NaOH组成。SDS——破细胞膜及壁，解聚核蛋白，并与蛋白质分子结合使之变性；NaOH(pH>12)——破坏氢键，使DNA分子变性，同时强碱也使蛋白质变性，减轻核酸酶对质粒DNA的降解作用的可能性。溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为4.8~5.5的高盐溶液。中和溶液II的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离，此外，高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。三、实验材料1、仪器和材料大肠杆菌(E.coli)单菌落或冻存菌种。恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、Ep（Eppendorf）管（1.5mL微量离心管）、取液器（20μL~lmL）、吸头。2、试剂

(1)DNA提取溶液（溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，见附录）

(2)TE缓冲液（pH8.0）

(3)酚:氯仿液(酚:氯仿=1:1)(4)无水乙醇，70％乙醇

(5)LB培养液

(6)氨苄青霉素（终浓度为50~100μg/mL）

(7)RNA酶（10mg/mL贮藏液）四、实验步骤转移上清至另一新Ep管

4℃，12000r/min，10min

加150μL冰预冷的溶液Ⅲ，倒转，轻轻震荡，使充分接触，置冰上3~5min

加200μL新配置的溶液Ⅱ，倒转混匀，勿震荡加入100μL的溶液I，充分重悬细菌沉淀上清液中加等体积酚:氯仿溶液，振荡混匀

4℃，

12000r/min离心5min，小心吸去上清，得到DNA沉淀加2倍体积预冷的无水乙醇，振荡混匀，室温放置2min

小心吸取上层水相，转移至另一新Ep管中（注意分界处的白色蛋白薄层）

4℃，12000r/min，5min

（二）碱裂解法提取质粒DNA

用枪轻轻吹吸沉淀，使充分重悬400μL700μL（三）纯化质粒DNA加lmL预冷的70％乙醇，洗涤沉淀4℃，12000r/min，5min，小心去上清，留沉淀，室温蒸发痕量乙醇10~30min

用20μL含有胰RNA酶（20μg/mL）的TE(或无菌双蒸水)，重新溶解DNA，贮存于-20℃备用五、预期结果若所取菌液量大，一般经乙醇沉淀离心后，肉眼会看到Ep管壁一侧有灰白色沉淀物，其定性及定量需进行电泳检测。六、注意事项l、提