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文档简介

细胞器的分离、纯化

——细胞分级分离法

学习细胞器的分离及纯化的一般原理和方法。一、实验目的

细胞分级分离法是一种通过离心从而分离细胞内不同结构成份的细胞器(包括核、叶绿体、线粒体、微体等)以研究其形态结构，化学组成成份和生理活性的方法。

这个方法包括匀浆化，分级分离，分析三个步骤。通过匀浆化得到细胞匀浆液；把匀浆液放在一定的液体环境下，在离心机中进行离心分离处理。因为离心力的作用，可以把细胞内比重和大小不同的各种结构分开。二、实验原理

细胞器的沉降速度取决于辐射向外的离心场，我们通常用相对离心场表示：

RCF=1．11×10-5·n2r

其中RCF为相对离心场(单位为g)；n为转数(单位为转数／分)；r为离心半径(单位是cm)

(一)材料：新鲜菠菜(二)器械：显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心管、200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器等。三、实验用品

1．线粒体离心匀浆介质：

0.25M蔗糖。0.067MPH7.2PBS，

0.05MEDTA，0.75mg／ml牛血清白蛋白。2．l％JanusgreenB的O．25M蔗糖溶液。3．0.05MTris—HCl液体PH8.0

0.02MTris55ml

0.1NHCl55ml

蒸馏水200ml4．0.35mol/lNaCl(三)试剂

(一)玉米黄化幼苗线粒体的分离(整个过程保持在O-4℃)1．将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约取5g，在冰箱中放置l小时。2．将幼苗剪碎直接倒入研钵中，以1：3(重量体积比g：m1)比例加入离心匀浆PBS介质，快速磨碎，注意先加入少许介质液，研碎后再将余液加入。3．用双层尼龙网过滤，除去残渣。4．取滤液在低温高速离心机上2300rpm离心lO分钟，弃沉淀。

四、实验方法

5．取上清液在低温高速离心机上9950rpm离心10分钟，弃上清。6．所留沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rpm离心10分钟．弃上清。7．将所得沉淀悬浮于0.5M、PH7.2甘露醇中，置冰箱备用。

8．将制备的线粒体悬液滴于干净的载玻片上，用1％JanusgreenB的0.25M蔗糖液(PH7.4)染色20分钟。9．加盖玻片(需特别干净)。镜检最好用相差显微镜,凡线粒体均被JanusgreenB染成蓝绿色颗粒，检验制备线粒体的纯度。1．取去叶脉的新鲜菠菜5g于研钵中，加入0.35mol/lNaCl15ml研磨。注意开始研磨时也是先加入少许介质，磨碎后再加入剩余的。2．绿色的匀浆液用尼龙网(200目)过滤．滤液分别转入两支干净的离心管中，以1000rpm离心4分钟．除去沉淀。3．上清液在高速低温离心机上以3000rpm离心5分钟，所得沉淀即为叶绿体。4．用0.35mol/lNaCl液(视沉淀多少)稀释，置冰箱中保存备用，在

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