微生物的诱变育种

微生物的诱变育种第一页，共二十三页，2022年，8月28日一、诱变育种中的几个原则

指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。2个主要环节：诱变（随机）选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。筛选（定向）设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。第二页，共二十三页，2022年，8月28日（一）出发菌株（originalstrain）出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、标记明显等）；对诱变剂敏感野生型菌株；从生产中选育的自发突变菌株；诱变获得的高产菌株出发菌株的选择标准：出发菌株的来源：第三页，共二十三页，2022年，8月28日（二）菌悬液的制备1.选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂；

②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）2.同步培养（生理状态一致）3.菌龄：对诱变剂最敏感时期

营养细胞：对数期孢子或芽孢：萌发前期4.菌悬液的制备方法

物理诱变：生理盐水配制化学诱变：缓冲液配制5.菌悬液的浓度

酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL

细菌，放线菌孢子：108个/mL

第四页，共二十三页，2022年，8月28日（三）诱变剂的选择及处理方法1.诱变剂的选择（高效，简便）物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便；

化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。(NTG——超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂第五页，共二十三页，2022年，8月28日2.剂量的选择突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量,反而会使突变率下降。正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%,甚至30~70%的剂量。UV的剂量:固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异向正突变范围移动的剂量。常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）第六页，共二十三页，2022年，8月28日3.诱变处理方法单因素处理或多因素的复合处理：①同一诱变剂的重复使用；②两种或多种诱变剂的先后使用；③两种或多种诱变剂的同时使用.第七页，共二十三页，2022年，8月28日（四）中间培养（CM，培养过夜）目的：克服表型延迟表型延迟（phenotypiclag）：表型的改变落后于基因型改变的现象.

分离性延迟：

突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。

生理性延迟：

由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能表现出来。分离性延迟的原因:对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。生理性延迟的原因:当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。生理性延迟:第八页，共二十三页，2022年，8月28日（五）突变株的筛选

初筛复筛1.初筛（以量为主）（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性（2）根据平板颜色反应直接挑选透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；抑菌圈法（抗生素）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标）2.复筛（以质为主，定量测定）摇瓶培养，直接检测所需产物方法需简便、快速2步第九页，共二十三页，2022年，8月28日诱变育种的基本原则：选择简便有效的诱变剂；挑选优良的出发菌株；处理单细胞或单孢子悬液；选用最适的诱变剂量；充分利用复合处理的协同效应；利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；设计高效筛选方案；创造新型筛选方法。第十页，共二十三页，2022年，8月28日二、几种重要突变株的筛选方法1.抗性突变株的筛选(1)抗终代谢物结构类似物突变株的筛选(2)抗药性突变株筛选2.营养缺陷型的筛选第十一页，共二十三页，2022年，8月28日

1.抗性突变株的筛选

（1）抗终代谢物结构类似物的突变株

用途：筛选相应代谢物的高产菌株（2）抗药性突变株

用途：筛选相应药物(抗生素)的高产菌株或遗传标记制作

筛选的方法:

a.高于临界浓度的平板进行分离；

b.梯度平板法

敏感菌苔

抗性菌落加入含异烟肼的上层

加入不含异烟肼的底层

所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质。如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?第十二页，共二十三页，2022年，8月28日2.营养缺陷型突变株的筛选（1）几个概念：三类培养基：基本培养基（MM,minimalmedium）[-]：某野生型能生长的最低成分的组合培养基。完全培养基（CM,completemedium）[+]：各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基补充培养基（SM,supplementalmedium）[A]:[-]+A[B]:[-]+B相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基第十三页，共二十三页，2022年，8月28日三种遗传型：野生型（wildtype）从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。[A+B+],可在[-]生长。营养缺陷型（auxotroph）野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。

[A+B-]：能在[+]、[B]生长

[A-B+]：能在[+]、[A]生长

[A-B-]：能在[+]生长原养型（prototroph）营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求[A+B+],可在[-]生长第十四页，共二十三页，2022年，8月28日（2）筛选步骤（5步）诱变处理中间培养淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型第十五页，共二十三页，2022年，8月28日①中间培养CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。②淘汰野生型即浓缩缺陷型，以提高检出率方法

抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素）

菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）

饥饿培养（无N）MM6~12h2N培养(2N)MM1~2h加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜第十六页，共二十三页，2022年，8月28日③营养缺陷型的检出方法逐个检出法夹层培养法限量补充培养法影印平板法第十七页，共二十三页，2022年，8月28日④营养缺陷型的鉴定生长谱法：快速，直观分两步：a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定b.具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸,哪一种维生素,或哪一种碱基)具体操作:一般采用“滤纸片法”第十八页，共二十三页，2022年，8月28日

a.不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液

b.维生素混合液

c.0.1%碱水解酵母核酸液abc三大类营养要求的鉴定：第十九页，共二十三页，2022年，8月28日以氨基酸缺陷为例进行说明将18种氨基酸按右表分为6组特点：每2组只有一种共同物质单一营养物质要求的鉴定：组别化合物代号117891011227121314153381216171844913161920551014171921661115182021135246第二十页，共二十三页，2022年，8月28日（3）营养缺陷型的用途生产菌(氨基酸、核苷酸、维生素等高产菌需求)；研究代谢途径和杂交、转化等遗传规律的遗传标记。第二十一页，共二十三页，2022年，8月28日

诱变育种的程序：实验讲义p175

出发菌株（纯化）前培养（CM，培养至对数期）

菌悬液制备活菌计数

诱变预备实验（剂量存活率曲线）

诱变处理（相对杀菌率为70-75%，30-70%）活菌计数

中间培养（CM，培养过夜，克服表型延迟）

突变株分离

初筛

复筛