基因操作原理08课件

第八章DNA文库的构建DNAlibraries基因文库（Genelibrary）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。

即Genomiclibrary1976年L.Clark,J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式n=ln(1-p)/ln(1-f)n:一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f:插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值cDNA文库:若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库一、载体的选择第一节

基因组DNA文库的构建可装载的外源DNAPlasmid<10kbPhage0-23kbCosmid~45kbBAC~100kbYAC~300kb-1.2Mb粘粒克隆所需的克隆子数是phage的一半，如需700000时，cosmid需350000个如无特殊需要(如单个phage不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存文库比phage困难得多1．phagevectors早期（70年代后期）使用，如Charon4A和gt-WES，克隆15～20kb目前用EMBL系列,2001，DASH，Charon38-40，GEM-11等置换型载体，插入片段的最大值可达20-24kb·选择载体要考虑的因素

易于从重组噬菌体中回收插入的外源DNA

易于制备两臂

载体的可知性，如序列，图谱

载体臂上的琥珀突变，利用特殊筛选系统

重组体中有活性的gam基因

载体臂上的chi序列2．Cosmidvector所有cosmidvector均可用于构建文库，但建议尽量使用pJB8和c2RB，因为经验较多，许多问题易于解决·载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖

或NaCl）

梯度离心的收获量大，而agarose回收量小

回收无填充片段

聚乙二醇沉淀，除去碎片置换型载体coscosRLCentralstuffer3．基因组DNA的消化

一般采用Sau3AI消化

回收20-24kb（agarose法or梯度离心）

·有些载体可做不完全补平4．连接/包装

连接形成较长的多联体，包装成粘粒（4℃6个月稳定）5．扩增和保存重组phage可在E.coli中扩增，所得文库可被长时间利用和贮存，可用于多个不同基因的筛选6．在宿主菌上形成噬菌斑7．带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定8．对选出的重组phage进行噬斑纯化，再对外源DNA进行分析

基因组DNA片段3’凹端的不完全补平-GATC--CTAG--GATC--CTAG-Sau3AI-GAGATC--CTAGAG-KlenowdATP/dGTP-CTCGAG--GAGCTC-XhoIKlenowdCTP/dTTP-CTCTCGAG--GAGCTCTC-互补GEM-11基因组DNAVector三、重组体的筛选和分析

噬斑原位杂交将噬菌体以一定密度铺于平板，并影印到固相膜上要从哺乳动物DNA文库里筛选出目标基因，哺乳动物基因组复杂度为3×109bp，必须筛选几十万个噬斑不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目四、亚基因组文库的构建用基因组DNA的特定部分所构建的基因文库质粒DNA，线粒体DNA,特定限制性片段在有杂交探针的情况下，可通过Southern杂交，先找出目标基因所在的限制性片段的大小，然后用相应大小的限制性DNA片段构建出基因文库，这样可减少筛选的压力。例如

将基因组DNA用多种限制性内切酶切割，

通过Southern杂交

则

将SpeI切割的基因组DNA中的~8.3kb片段回收，用于构建DNA文库发现目标基因在8.3kbSpeI片段上一、cDNA克隆用的mRNA第二节cDNA文库的构建2．mRNA的丰度

高丰度mRNA

珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白

在特定细胞中占50-90%

低丰度mRNA0.5%被称为低丰度或稀有mRNA文库应足够大，鉴定和分离困难3．mRNA的富集

按大小对mRNA进行分级分离

分离不同大小的mRNA（先变性，如氢氧化甲基汞，后梯度离心，蔗糖）

体外翻译，检测每份中的比活

cDNA的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA,agarose分离大小易辩

多聚核糖体的免疫学纯化法用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体·

免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo(dT)层析分离mRNA。·

此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05%·

并非都可用，根据材料\来源\特异性来选择

反转录酶

AMV(42℃)M-MuLV(37℃)

RNaseHRNaseH弱

长mRNA

引物

oligo(dT)12-18

一般要求浓度高

模板

氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构

RNase

抑制剂AAAAAAAmRNA5'3'TTTTTTTT二、cDNA第一链的合成cDNA1．自身引导法三、cDNA第二链的合成2.置换合成法

有效

无须进一步纯化

不需用S1酶，否则会导致cDNA的大量损失问题：

如何脱帽以便进入载体

5’端cDNA不能合成（少几个Nt）

有可能仍形成发夹结构3.第二链引导合成Okayama-Berg方法4.引物-衔接头合成法四、dscDNA的分子克隆1.同聚物加尾问题：

只对质粒有效，文库不易保存和复制。

尾的长短不一

(100dA/dT,20dG/dC)

同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E.coli的效率随宿主不同而不同。2．合成接头和衔接头cDNA合成接头(含酶切位点)酶切NotI,SalI与载体连接Optional:methylation

接头中含稀有位点，如NotI,SalI(100kb一次)先甲基化ds

cDNA，再连接接头用衔接头替换接头用衔接头替换接头3.其他方法(1)mRNA-cDNA杂交体克隆mRNAcDNAAAAAAAAARNA末端加尾效率只及DNA的1/10合成第一链后,加尾,与带dT尾的载体退火,在宿主体内,可除去RNA,代之以DNA优点:无须合成第二链,序列完整

但效率<1/10(2)依次连加不同接头(3)RACErandomamplificationofcDNAendscDNA克隆是常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆

筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆，

而RACE可产生大量独立克隆mRNAcDNATTTTTTTT-QI-QOAAAAAAAA.经典RACE3‘末端克隆TTTTTTTT-QI-QO反转录QOPCRGSP1QIGSP2根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计引物GSP1和GSP2PCRcDNA克隆中,得到了不完整的片段,可采用此方法获得3‘末端和5’末端的序列5‘末端克隆mRNAAAAAAAAGSP1GSP1AAAAAQ1-Q2-TTTTTTQ1/GSP1PCR反转录Q2/GSP2PCRGSP2获得的cDNA克隆片段AAAAAAAGSP1反转录连接RNA寡聚物NNNNNNNNB.新RACE(4)其他与cDNA第二链合成有关的方法，如

Okayama-Berg方法和引物-衔接头合成法五、cDNA克隆用的载体1．gt10和gt11gt10:可用核酸探针

克隆0-6kbEcoRI插入后载体变cI-cI+在hflA中发生溶原GenBank:U02447gt11：表达载体，可用免疫探针

克隆0-7.2kb可表达融合蛋白LacZE.coli

C600allowinggrowthofparentalandrecombinantphageC600hflrepressesparentalphagegrowth50-100-fold,recombinantphageformclearplaquesandparentalphageformturbidplaquesE.coli

LE392allowinggrowthofparentalandrecombinantphageY1090asthehost,42C形成噬斑适合用免疫学探针筛选2.ORF89kb可用于定向克隆3．其它gt18，19，20，21，22，23，ZAP第三节

基因克隆的策略基因克隆的本质从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”常见筛选工具:探针狭义:核酸,抗体广义:还包括其他筛选手段抗性基因:antibiotics抗性基因,抗重金属活性一、功能筛选

分解基因:苯环化合物,分解酶

功能活性：杀虫，酶

启动子/复制子利用目标基因的特定功能进行筛选AmporiMCSTetgenewithoutpromoterVector将目标DAN切割成小片段,插入MCS在Tet平板上筛选抗性菌落,可得到promoter其他标记:gfp,Kan质粒复制单位的克隆AmporiMCS目标宿主可用的抗性gene将目标DAN切割成小片段,插入MCS在抗性平板上筛选抗性菌落,可得到质粒复制单位

功能缺失在获得相应突变体的前提下以此突变体作为宿主在野生型的DNA导入后检测回复突变如

营养缺陷型

相关的基因二、核酸探针

同源DNA探针高度保守的基因rRNA基因邻近种属的相应基因相应基因的序列比较

合成寡核苷酸蛋白质N-末端aa序列简并探针degeneracy选取简并程度低的aa序列

综合合成可能的话

设计一对,用PCR产物作探针根据密码子的使用频率,合成猜测体探针设计两组简并探针,用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交三、免疫在可获得PT后,制备抗体,用于筛选四、高表达基因高丰度mRNA,如

用苯肼作了贫血处理的兔网织红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数五(1)、差别杂交五(2)、扣除杂交Tcell(TCR)BcellmRNAmRNAcDNAcDNA:mRNA杂交体过量通过羟基磷灰石柱,吸附杂交分子Tcell(TCR)特异的cDNA流出cDNA第二链合成生物素标记生物素结合蛋白柱六、mRNA差别显示mRNA3’末端

有12中可能的序列以此12种引物引导cDNA第一链合成引物:5‘-T11MN或5‘-T12MN

M=A,G,orC以10核苷酸随机引物引导cDNA第二链合成(PCR)

可产生50-100条100-500bpDNA条带12种锚定引物和20种随机引导组成240组引物,产生约20000DNA条带Sequencinggel`对两个相近品种的mRNA作上述处理,比较它们产生DNA扩增条带的差异,找到

单方具有的特异DNA条带,则可能找到特异性表达的基因,回收并克隆特异性的条带,分析其序列,以此条带为探针克隆全长基因。七、酵母双杂交系统用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的蛋白质基因GAL4