第五章DNA损伤与修复

第五章DNA损伤与修复

DNAdamageandrepair秘晓林BIXiao-Lin09/25/2015基本情况博士，教授，博士生导师中国科学院“百人计划”，辽宁省“攀登学者”主要研究方向：

肿瘤抑制因子功能与作用机制；DNA损伤应答过程中关键蛋白的定位与功能；参与DNA损伤应答的ncRNAs等EMAIL:BIXL@DMU.EDU.CN

为什么要研究DNA损伤应答？(DNADamageResponse,DDR)DNA损伤类型和数量TYPEOFDAMAGEevents/cell/day%oftotaldailydamageSingle-strandbreak120,00050.9N7-MethylGuanine84,00035.6Depurination24,00010.2OxidizedDNA2,8801.2Depyrimidation1,3200.5Cytosinedeamination3600.2Double-strandbreaks90.01DNA损伤与疾病第一节DNA损伤何谓DNA损伤？在内源或外源因素作用下，DNA结构发生的任何改变都称为DNA损伤DNA损伤的后果：一、DNA失去作为复制和转录模板的功能，导致细胞死亡；二、DNA的结构发生永久性改变一、DNA损伤的类型碱基的更替、缺失、插入、链的断裂、链内或链间的交联、DNA重排等。天然的线性染色体末端—端粒？二、损伤因素内源因素：染色体复制、活性氧等外源因素：紫外线、电离辐射、碱基类似物、修饰剂、烷化剂、化学诱变剂等。三、突变的类型1.点突变：是指DNA分子中一个碱基的改变。包括转换（嘌呤碱基→嘌呤碱基）和颠换（嘌呤碱基→嘧啶碱基或嘧啶碱基→嘌呤碱基）2.插入突变：是指DNA分子中插入多余的碱基。3.缺失突变：是指DNA分子中碱基的丢失。插入突变和缺失突变可引起移码突变。4.三联体扩增：脆性X染色体综合征是由于FMR-1基因中CGG重复突变5.DNA片段重组四、突变的后果1.中性突变基因突变（特别是点突变），不一定就是有害突变。突变是生物进化和分化的分子基础；只有基因型改变的突变，即碱基组成改变，但蛋白质分子中氨基酸未改变。如有些点突变发生在同义密码子的第二或第三位碱基，或发生在基因的内含子上。因此突变不一定就是损伤。Pointmutation---GCG------CGC------GCC------CGG---精氨酸精氨酸2.有害突变严重的突变或突变的长期积累，导致DNA复制障碍或不能进行，或基因表达异常，引起DNA损伤导致疾病。因此突变是某些疾病的分子基础镰状红细胞贫血-点突变第二节DNA损伤的机制一、自发性损伤1.DNA复制过程中的碱基错配（错误率为10-9，修复后降为10-10

）2.三联体扩增（即三核苷酸重复）是指三个不同的碱基为一个单位重复排列而形成的DNA序列。理论上，基因组中应该含有10类60种三核苷重复DNA序列。如CAG\CTG、GAA\TTC等三核苷酸重复序列。其中，CAG\CTG、GAA\TTC、CGG\CCG等三核苷酸重复序列序列与20种以上的神经-肌肉系统退行性疾病的发病有关。这些三核苷重复序列可以出现不明原因的扩增，从而累及所在或周围基因的正常表达或正常的生物活性。19q13.2~19q13.3果蝇FMRP调节DNA损伤导致的细胞周期检验点和凋亡fmr突变导致DNA损伤敏感FMRP工作模式Liuetal.HumanMolecularGenetics.20123.碱基的烯醇式-酮式或氨基-亚氨基异构体互变引起碱基错配4.自发脱氨基C→U引起U→A、A→I引起I→C、G→X（无配对碱基）5.碱基丢失引起突变3´5´3´5´二、环境因素诱发DNA损伤分子机制（一）紫外线引起DNA损伤的机制当DNA暴露与260nm的紫外线时，DNA链相邻的嘧啶碱基可形成5，6双键，产生嘧啶二聚体—TT、TC或CC，最常见为TT二聚体。人皮肤细胞受紫外线照射形成二聚体的可达5×104/细胞/小时。此外，紫外线还可引起DNA链间交联、DNA与蛋白质交联、甚至断链。（二）电离辐射引起DNA损伤的机制1.可导致DNA碱基改变电离辐射可产生OH自由基，引起DNA链上碱基氧化修饰（如T转变为5-羟甲基尿嘧啶）、碱基开环（如腺嘌呤7，8-双键断开）和脱落。嘧啶与嘌呤更敏感。2.可导致DNA断链.OH自由基破坏脱氧核糖脱落或断裂3′，5′-磷酸二酯键使DNA断链3.可导致DNA链交联电离辐射可使同一条DNA链内或两条DNA链之间或DNA与蛋白质间发生交联。三、烷化剂引起DNA损伤的机制烷化剂是亲电子化合物，分子中带有活性烷基。活性烷基可转移到DNA的碱基或磷酸基上，使之烷基化。鸟嘌呤最易烷基化。烷化剂包括芥子气、硫酸二乙酯、甲基-亚硝基胍、甲基甲烷碘酸、氮芥、硫芥、环磷酰氨、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等1.可导致碱基错配烷基常加到碱基的N（N7烷基化鸟嘌呤G或N3烷基化腺嘌呤A）或O原子上，使烷基化的G与T配对。2.可导致碱基脱落烷基化鸟嘌呤的糖苷键不稳定而断裂，使DNA链产生无碱基位点，复制时可插入任何碱基。2.可导致DNA断链磷酸基上O的烷基化，使3′，5′-磷酸二酯键断裂4.可导致DNA链的交联四、碱基类似物引起DNA损伤的机制碱基类似物在结构上与碱基相似，它们进入体内后，在DNA复制过程中，可替代碱基掺入而干扰DNA合成，引起碱基错配。碱基类似物包括5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤等。五、化学修饰剂和化学诱变剂引起DNA损伤的机制化学修饰剂能专一地修饰DNA分子的碱基导致碱基错配如亚硝酸盐（使C氧化脱氨基变成U，导致G-C转变为A-T，或使A氧化脱氨基变成I，导致A-T转变为G-C）、羟氨（使T脱甲基变为C，导致A-T转变为C-G）致癌物黄曲霉素B也是导致序列的变化。丫啶类化合物、溴化乙啶等也引起DNA损伤。第三节损伤DNA的修复在一定条件下，损伤的DNA分子恢复正常的过程。修复方式有：直接修复、切除修复、重组修复、跨

损伤修复和SOS修复一）、光修复光复活酶（即光裂合酶）直接修复嘧啶二聚体（见于细菌和低等真核生物）光复活酶300~500nmUV照射一、直接修复二）、DNA连接酶直接修复DNA断裂口三）、烷基化碱基的直接修复例如，E.Coli的Ada酶和人类的O6甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）可将烷基不可逆地转移到自身而完成修复，本身失活（自杀修复）。四）、DNA嘌呤插入酶直接修复无嘌呤位点（APsite）二、切除修复—最普遍和常见的修复方式切除修复需要DNA特异内切酶、核酸外切酶、糖苷酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与。包括单个核苷酸切除和核苷酸片段切除修复。切除修复属于复制前修复ACUTCATGGAGTACG*TCATGGAGT糖苷酶ACG*TCATGGAGTAP内切酶和外切酶ACCTCATGGAGTDNA聚合酶DNA连接酶1.单个核苷酸切除修复2.核苷酸片段切除修复

--UvrABC修复系统具有ATP酶活性的UvrA

与UvrB结合，并识别

与结合DNA损伤部位。

具有内切酶作用的UvrC

置换出UvrA，与UvrB-DNA结合。UvrD（DNA解旋酶Ⅱ）释放

切

下的损伤片段。DNA聚合酶Ⅰ填补缺

口，并由DNA连接酶

连接。人类着色性干皮病（xerodermapigmentosis,XP）常染色体隐性遗传。皮肤对日光，尤其是对紫外线敏感。主要临床表现是皮肤雀斑样色素沉着，毛细血管扩张，局限性萎缩，疣状增生，浅表溃疡，最后可癌变。这种病人的XP类基因（XPA、XPB、XPC、XPF、XPG）有缺陷，导致DNA损伤后的修复障碍。3.错配修复當DNA复制時，掺入了错误的碱基，在校读时未被去除，可经由该通路的酶侦测出來，将其中一股切出，并加以修补。三、重组修复--复制后修复四、跨损伤DNA合成修复跨损伤DNA合成（TranslesionDNASynthesis,TLS是近年来新发现的参与DNA修复的又一机制。TLS包括无错损伤旁路（error-freelesionbypass）及易错损伤旁路（error-pronelesionbypass）；易错损伤旁路可导致DNA损伤诱导的突变。

跨损伤DNA合成，这是一种利用损伤核苷酸为模板，通过跨损伤DNA聚合酶使碱基掺入到复制终止处进行DNA合成，从而延长DNA的修复。

五、SOS修复—诱导修复SOS修复是细胞DNA受到广泛损伤而难以复制的紧急情况下，细胞为求生存而出现的一种应急反应。此时，细胞需调动其所有的修复系统进行修复。20世纪50年代，Weigle首次在E.coli中发现SOS修复系统。1973年，Raelman首次称为SOS修复。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错修复（光修复、切除修复和重组修复）和倾向差错修复。诱导产生缺乏校正功能的DNA聚合酶，一方面进行修复，同时也容易造成碱基错配的机会而产生新的损伤。但总的结果是细胞可以生存下去。SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物蛋白相互作用引起的，LexA（22kD）阻遏物蛋白是许多基因的阻遏物。RecA蛋白是SOS反应的最初发动因子。在ATP存在时，RecA被损伤的DNA激活而表现出蛋白水解酶活力，水解LexA阻遏物蛋白，使与修复有关的基因开放，表达产物即可对损伤的DNA进行修复。DNA损伤修复缺陷与疾病DNA损伤应答的若干关键因子

与损伤的时间和空间关系Checkpointp53:“GuardianofGenome”肿瘤抑制因子最初鉴定为癌基因获得性功能“Gainoffunction”超过50%的肿瘤中突变或异常主要功能细胞周期检验点(checkpoint)凋亡p53突变导致不同的转录谱Kollareddyetal.NATURECOMMUNICATIONS|Published12Jun2015|6:7389什么是端粒(telomere)天然的染色体末端染色体末端由DNA和蛋白质共同构成的结构来源于希腊语telos=endmeros=part保护端粒的“T-loop”结构端粒的功能维持染色体末端保护染色体不发生融合、降解等荧光原位杂交检测端粒

（FluorescenceInSituHybridization,FISH)telomeresred

centromeregreen端粒长度端粒随细胞分裂缩短MitoticclockofthecellHuman:15-20kb,50-100bp/celldivision50-100divisions端粒与DNA损伤unprotectedtelomeretelomereDSBSharedmanyproteinsDNAdamage?TelomeresshortenwithsuccessivecelldivisionsintheabsenceoftelomeraseDNA-damageresponsecausescellsenescenceorcelldeathLossoftelomerecapleadstoDNA-damageresponseTelomeresChromosomefusionChromosomesalignduringmetaphaseFusedchromosomeisstretchedduringanaphaseChromosomalbreakageresultingingenomicinstabilityCancer,aging,impairedstem-cellfunction,anddyskeratosiscongenita端粒缺陷,DNA损伤和疾病干细胞的DNA损伤应答与癌症和衰老2009年Nobel生理学或医学奖"forthediscoveryofhowchromosomesareprotectedbytelomeresandtheenzymetelomerase".ElizabethH.BlackburnCarolW.GreiderJackW.Szostak2015年Lasker基础医学研究奖“FordiscoveriesconcerningtheDNA-damageresponse—afundamentalmechanismthatprotectsthegenomesofalllivingorganisms.”参考文献综述类：AnnualReview,NatureReview,Trends,CurrentOpinionetc.Goldsteinetal.(2015)."TheDNAdamageresponse:implicationsfortumorresponsestoradiationandchemotherapy."AnnuRevMed66:129-143.Smeenketal.(2013)."ThechromatinresponsetoDNAbreaks:leavingamarkongenomeintegrity."AnnuRevBiochem82:55-80.Armanios.(2009)."Syndromesoftelomereshortening."AnnuRevGenomicsHumGenet10:45-61.SanFilippoetal.(2008)."Mechanismofeukaryotichomologousrecombination."AnnuRevBiochem77:229-257.Palmetal.(2008)."Howshelterinprotectsmammaliantelomeres."AnnuRevGenet42:301-334.McKinnonetal.(2007)."DNAstrandbreakrepairandhumangeneticdisease."AnnuRevGenomicsHumGenet8:37-55.Durkinetal.(2007)."Chromos