流式细胞仪分析技术及应用(课件)

第一节概述一、 工作原理第一节概述一、 工作原理二、 散射光的测定三、 荧光测量四、 细胞分选原理第二节数据的显示与分析一第二节数据的显示与分析一、 参数二、 数据显示方式三、 设门分析技术一、 免疫检测样品制备二、 免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、 免疫胶乳颗粒的应用四、 流式细胞技术的质量控制第四节流式细胞仪技术的要求第五节、流式细胞仪的科研应用第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用流式细胞术（flowcytometry,FCM）亦称荧光激活细胞分选器（fluorescence-activatedcellsorting,FACS）:是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。◊流式细胞术发展史1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1949年WallaceCoulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器1969年VanDilla及其同事在LosAlamos,NM发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出细胞分选器1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂目前国内主要流式细胞仪厂家：BecktonDickinson（BD）公司；BACKMANCOULTER公司流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量主要特点：1.单个细胞水平分析；2.多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；3.灵敏度高；4.可分析大量细胞；5.速度快：5000-10000个细胞/秒；6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。第_节概述流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。一、工作原理①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；③用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。分为三大类：（1）类为台式机（临床型）：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。（2）类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。（3）类为新型流式细胞仪：15个参数同时分析。高速分选速度达到50,000个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。流式细胞仪常检测的细胞特性一、工作原理①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；③用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。大小 细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度 细胞活性DNA,RNA含量 胞内细胞因子蛋白质含量 激素结合位点钙离子,PH值，膜电位酶活性 概括为三个系统结构：（1）液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。（2）光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射流式细胞仪分析技术及应用——温医细胞生物学技术的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。主要光学原件是滤光片，主要分成3类：1、长通滤片：（LP）:LP500滤片允许500um以上光通过，而500Um以下光吸收或返回。2、短通滤片（SP）:与长通滤片相反，如SP500滤片允许500um以下光通过，500um以上光吸收或返回。3、 带通滤片（BP）:带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500表示其允许通过波长范围为75um-525um。(3)数据处理系统流式细胞仪与显微镜的区别区别流式细晌仪显微镜压电晶体产生机彼振动光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等涯动窒森动承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色PMT、放大电路目镜乂物镜、光学放大液淀零燹成液滴放大万式统计计算机，＞5000人工，200结果多参数，综合分析简单，单参数、二、 散射光的测定散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞 空白浪滴 令纣汉的浪滴的物理参数。（波长与激光相同。）主要分为： 不八 ,占前向散射光（0°散射）FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴个I较小角度（0.5°〜10°）向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的 •在去 侑^落人改-箕君表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。侧向散射光（90。散射）SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。三、 荧光信号（FL）测量当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于90o方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。常配置的激光器波长为488nm。 633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA样本极易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2M期细胞相等，这样得到的测量数据G2M期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。四、 细胞分选原理（图示见上）通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。1、 细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。2、 从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。3、 符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液

流式细胞仪分析技术及应用——温医细胞生物学技术滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度（二）FCM分选指标分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5000个/秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二节数据的显示与分析常用数据显示方式：单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图、设门分析技术目前FCM数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4个，采用listmode方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4个参数，那么获取10000个细胞，所占容量为4X10000个（字或双字）。同时当只检测1个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3个参数，节省3/4的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。一、 参数FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度oFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。二、 数据显示方式（一） 单参数直方图 由一维参数（散射光或荧光）与颗粒计数（COUNT）构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。（二） 双参数直方图 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图等高线图,二维密度图。在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2中二个参数作为X轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体；X坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y坐标为该细胞另一参数的含量。在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。（三） 二维等高图 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高（越里面的线）所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。（四） 三参数直方图 在三维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2中二个参数作为X轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。（五） 流式细胞仪的多参数分析 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。三、 设门分析技术Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第四节流式细胞仪技术的要求一、免疫检测样品制备细胞样品制备要求：1、 单细胞悬液；2、 细胞最适密度0.5X106-1.5X106个/ml；3、 荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底；4、 双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色；5、 如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备： 单细胞悬液的保存：

流式细胞仪分析技术及应用——温医细胞生物学技术机械法（金属网引起细胞破碎） 深低温保存法（一年）酶处理法（选择最适宜消化酶） 乙醇或甲醇保存法（2周）化学试剂处理法（导致细胞成活率降低） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）表面活性剂处理法注意事项：1、 新鲜组织标本应及时进行处理保存；2、 根据实验目的选择最隹的固定方法；3、 酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。4、 需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织一一淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞;5、 在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤一一食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。二、常用的荧光染料与标记染色适用条件：有较高的量子产额和消光系数；②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示:F=Q（I-e8CL）F表示荧光强度，Q表示光量子产额，I表示激发光强度，£表示消化系数，C表示染液浓度，L表示溶液厚度。③对488nm的激发光波长有较强的吸收；④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差；⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：FITC和PE等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器；APC和PC5等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm波长红光的氦-氖激光器。2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质;如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）；PE则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5和PerCP等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3或PMT4）,等等名称染料激发波长名称染料激发波长发射光或荧光颜色溶解性对PH敏感性特点异硫氧酸荧光素FITC488绿525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性得州红Texasred568红615不易不敏感稳定，偶联后量子产额低藻红蛋白PE488橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高藻青蛋白PC488红别藻青蛋白APC633红670能量传递复合染料PEcy5488红670易不敏感减少交叉，成本高常用的几类荧光染料（二）免疫荧光标记荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式嵌入结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法直标：干扰少，但需购买多种单抗间标：步骤多,干扰多,不需标记多种抗体组.合标记.三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。

流式细胞仪分析技术及应用——温医细胞生物学技术四、流式细胞技术的质量控制（二）免疫荧光染色的质控温度（二）免疫荧光染色的质控温度pH染料浓度固定剂适当的制备方式（不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等）试剂选择样品处理（蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等）实体组织来源标本用机械法温度25〜37°C,pH7.0〜7.2（三） 仪器操作的质控光路与流路校正：确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准：保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准：保证计数的准确性。（四） 免疫检测的质控同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第五节、流式细胞仪的科研应用1、细胞表型分析2、胞内蛋白的检测3、细胞周期和DNA倍体分析4、流式标准小球定量5、分选6、细胞内钙离子测量第六节、流式细胞术的临床应用1、细胞周期和DNA含量分析2、细胞凋亡的检测和分析3、血小板及血小板活化的FCM分析4、造血干细胞（CD34+细胞）的检测5、白血病和淋巴瘤免疫分型6、网织红细胞分析7、残余白血病检测8、淋巴细胞亚群分析9、肿瘤耐药基因分析10、AIDS病检测中的应用11、自身免疫病相关HLA抗原分析12、移植免疫中的应用1、DNA含量分析检测原理：DNA含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA含量分