植物转基因方法及特点和转基因沉默现象

1植物的遗传转化方法及特点

植物基因工程研究中的关键步骤之一是通过特定的方法将外源基因导入受体植物细胞内，使之发生定向的、永久性的遗传变异，即所谓的植物遗传转化（genetictransformation）。为了方便有效地将外源基因导入植物体内，人们不断地探索、发展新的植物遗传转化方法。目前发展较为成熟的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电击法、PEG法、花粉管通道法、微注射法、激光法等，其中基因枪法和农杆菌介导法是最为有效的两种方法。第1页/共21页第一页，共22页。1．1基因枪法

基因枪法（particlegunbombardment；microprojectilebombartment；biolistics）是1987年由美国康奈尔大学的Sanford提出的一种直接基因导入法，它避开了原生质体再生植株培养的困难和当时人们认为的所谓的农杆菌的宿主限制问题。这种方法是籍高速运动的金属粒将附着于其表面的核酸分子引入受体细胞，然后通过组织培养再生出完整植株。第2页/共21页第二页，共22页。由于基因枪法导入外源基因的技术本质上是一种物理过程，因此它具有不用原生质体再生培养、受体材料来源广泛、不受基因型限制、缩短了获得转基因植株的周期、获得的转基因植株变异率低、通常具有正常的育性等优点[1]。特别是在单子叶禾本科植物中得到了较为广泛的应用。但是基因枪法也有自身的缺点：转化效率不高，大多在0.1~1.0%的范围内，难以选择；外源基因序列常是多拷贝插入，从而导致基因沉默；转入的基因有时是呈非孟德尔遗传；费用较高等[4]。第3页/共21页第三页，共22页。1．2PEG法

PEG法是一种通过化学物质PEG（聚乙二醇）处理去壁的原生质体作为转化受体，改变细胞膜的通透性而使原生质体获得转化。Krens等首次通过此法在烟草中获得成功。此后许多人在双子叶和单子叶植物如烟草、矮牵牛、水稻、玉米等都获得了成功。由于PEG法的实验成本低廉、结果也较稳定、重复性好、无需特殊的仪器设备等特点，因而在发明起初也成为应用较为广泛的方法。但是此法具有明显的缺点：原生质体培养再生难度较大；受基因型限制；原生质体再生培养的转化植株变异率高，易产生白化苗；转化率低[4]。

第4页/共21页第四页，共22页。1．3显微注射法、电击法及激光法

显微注射法（microinjection）是用显微注射器将遗传物质注射到培养细胞中，通过组织培养最终获得转化植株。此项技术起初主要应用于动物，八十年代中期开始应用于植物的遗传转化。虽然该法具有DNA注射的准确性、预见性、克服远源杂交的困难等优点，但其又有工作效率低、表达不稳定等缺点，故其应用受到了限制。自基因枪法诞生以来，这种转化方法在植物上的应用走入了低谷[2]。第5页/共21页第五页，共22页。电击法（electroporation）是八十年代初发展起来的一种转化技术，首先在原生质体上运用此法将CAT基因（氯霉素乙酰转移酶基因）转移到烟草、胡萝卜、玉米等植物的原生质体中并得以表达[2]。此法的主要原理是在高压脉冲条件下，细胞膜上会出现瞬时可逆性开放小孔，为外源物质提供了通道，籍此导入DNA等遗传物质，达到转化的目的。激光法同电击法类似，一定波长的激光聚焦后直径达0.3~0.5微米时，高能量的激光束可引起细胞膜的可逆性穿孔，短时间内又可自动修复，因而可利用激光束将外源DNA导入到细胞中。Weber等利用此法将荧光素酶基因导入油菜叶绿体中，Toper转化烟草、中国的傅荣昭等转化小麦均获得成功[2]。激光法和电击法均可用于双子叶和单子叶植物，转化受体材料广泛。但这种方法的效率低是显而易见的，使用范围小，存在问题较多，发展缓慢。

第6页/共21页第六页，共22页。1．4花粉管通道法

花粉管通道法（pollen-tubepathway）又称子房注射法（overyinjection），是将外源DNA注入到子房中轴的胎座位置，经形成的花粉管胚囊，转化受精卵或胚细胞。这是一种在整体水平上的转化方法，可使外源基因转移的操作直接在栽培作物上进行，免除了细胞和组织培养程序，并可直接获得转化的种子，开创了整株活体基因转化的新途径。这种方法是中国科学院上海植物生理研究所周光宇等在长期的科学研究中建立和发展起来的。不过这种方法看似简单但操作要求极为严格[3]。第7页/共21页第七页，共22页。1．5农杆菌介导法

科学家们经过长期的研究发现，农杆菌中存在一种环状的、大小约150~200kb的质粒（tumor-inducingplasmid，简称为Ti质粒），植物肿瘤即是有Ti质粒上的一段DNA引起的，它通过特定的机制复制、切割、转移、整合到植物基因组中并表达，从而引起肿瘤的发生，这段DNA特称为T—DNA（transferredDNA）这是一种天然存在的遗传转化体系。人们利用这种天然的遗传转化体系将外源基因导入植物细胞，并利用植物细胞的全能性，通过组织培养，由一个细胞或一块组织再生成完整的转基因植株，此即农杆菌介导的遗传转化（agrobacterium-mediatedtransfermation）[18]。第8页/共21页第八页，共22页。农杆菌Ti质粒的T—DNA中带有Onc基因（致癌基因），它在植物细胞内编码植物生长素和细胞分裂素，使受浸染的植物细胞不受限制地增殖而致瘤。此外T—DNA还编码Opine类化合物，作为农杆菌代谢地氮源和碳源。Ti上的T—DNA是由两端两个不完整的25个碱基对的顺向重复序列所界定，由于T—DNA不含编码促使自身转移物质的基因，故可将其上的Onc基因及其它不必要的序列去掉，而插入要转化的目的基因序列，从而达到既不致使植物致瘤而又能改良植物的目的[18]。第9页/共21页第九页，共22页。农杆菌介导法与其它方法相比较具有许多优点：操作简便不需特殊仪器，培养周期短；技术最成熟，转化效率高；外源基因多以单拷贝插入，稳定性好；可以利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行特异表达；较少出现基因沉默现象[3，18]；可将较大片段DNA完整地转移到植物基因组中等[10，14]。不过由于T—DNA可以在植物染色体的任何区域内插入，就有可能导致有益基因的插入失活，因此外源基因插入问题尚有待于基因转移技术的进一步完善[3]。特别是在禾本科粮食作物的遗传转化方面还存在许多局限[18]。第10页/共21页第十页，共22页。2转基因植物中的基因沉默现象

近年来人们发现几乎在所有的转基因方法得到的转基因植株中，都有外源基因在整合进基因组后，出现基因沉默（genesilence）现象[11]，转基因在受体植株中的表达水平很不稳定。这已经成为植物遗传转化技术应用于基础和应用研究的严重障碍。因此研究外源基因沉默的分子机理及其相应的解决方法已经成为当代分子生物学研究的一个热点。目前对转基因植物中的基因沉默现象已经有了较为深入的研究，但对其分子机理的理解及相应的控制手段还很有限。第11页/共21页第十一页，共22页。转基因植物的基因沉默总体分为两类：转录基因沉默（transcriptionalgenesilencingTGS）和转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencingPTGS）[21]。基因沉默的方式分为顺式失活、反式失活和共抑制三种形式[15]。第12页/共21页第十二页，共22页。2．1植物转录基因沉默（TGS）

植物转录基因沉默的主要方式有两类：顺式失活和反式失活。当一个或多拷贝基因整合进入或接近高甲基化基因组序列时，转基因的顺式失活就可能发生。这种现象与果蝇中的位置斑驳效应（positioneffectvariegation）很相似[12]。植物中的甲基化可以象果蝇中的异染色质一样进行传递，当甲基化传递进转基因中时，就会导致基因沉默[19]。多拷贝基因整合进一个甲基化位点时也能产生顺式转录沉默，这种现象又与果蝇中的由于转基因重复延伸而导致的基因沉默现象类似，即所谓的重复诱导失活[5]。有时转基因以单拷贝插入一个高甲基化位点也能引起转录基因沉默[11]。总的来说甲基化（或超甲基化）和染色质凝集（异染色质化）是与转录基因沉默相关联的普遍特征[11]。第13页/共21页第十三页，共22页。植物转录基因沉默的主要方式有两类：顺式失活和反式失活。当一个或多拷贝基因整合进入或接近高甲基化基因组序列时，转基因的顺式失活就可能发生。这种现象与果蝇中的位置斑驳效应（positioneffectvariegation）很相似[12]。植物中的甲基化可以象果蝇中的异染色质一样进行传递，当甲基化传递进转基因中时，就会导致基因沉默[19]。多拷贝基因整合进一个甲基化位点时也能产生顺式转录沉默，这种现象又与果蝇中的由于转基因重复延伸而导致的基因沉默现象类似，即所谓的重复诱导失活[5]。有时转基因以单拷贝插入一个高甲基化位点也能引起转录基因沉默[11]。总的来说甲基化（或超甲基化）和染色质凝集（异染色质化）是与转录基因沉默相关联的普遍特征[11]。第14页/共21页第十四页，共22页。当基因导入一个并不连续的但具有沉默的同源序列的基因组时，活性的转基因也能失活和甲基化[15]，这种现象被称为“异位反式失活”（ectopictransinactivation），它能影响在相同启动子控制下的基因表达，即使是正在表达的编码序列也不例外[15]。这种特性表明启动子对这种转录沉默很关键，引发“异位反式失活”可能依赖于沉默位点通过指导DNA—DNA配对而干扰基因组其它位点，或者它可能涉及由沉默位点产生的可扩散传播的RNA起作用，这些RNA可通过RNA—DNA相互作用导致同源目标位点的基因沉默和甲基化[20]。第15页/共21页第十五页，共22页。2．2转录后基因沉默（PTGS）

转录后基因沉默可定义为转录能进行但mRNA不能积累而发生的基因沉默。它也可分为转录后顺式失活和转录后反式失活（共抑制）。迄今为止，已发现多例转录后顺式失活[65]，各种文献报道的结果初步表明，PTGS在单倍体和纯合体中发生的概率较杂合体要高，表现出基因剂量效应；使用双增强子的35s启动子比使用经典的35s启动子发生PTGS的频率要高[6，7]。根据前人的研究结果，Dehio和Schell提出了PTGS可能的分子机制——阈值假说（thresholdhypothesis）：PTGS是因为转基因RNA的过量产生造成的，当RNA超过了一定的阈值水平，通过RNA—RNA相互作用和/或反义RNA（cRNA）引发mRNA的不可逆降解。第16页/共21页第十六页，共22页。不过English等于1996年发现，并非所有的基因沉默体系中的转基因转录水平都是很高的[7]，表明还有其它一些因素起着引发基因沉默的作用。需要说明的是并非所有的转基因体系均发生PTGS，能够发生PTGS的转基因位点可能具有这些特点：第一，重复顺序的出现可能允许DNA—DNA的相互作用，甲基化、异染色质化等阻碍正确转录，产生异常RNA；第二，使用强驱动子驱动基因的表达，可能有助于提高RNA聚合酶的错误结合而产生异常RNA的含量，当达到阈值水平时引发PTGS。也可能因异常RNA和mRNA在细胞质中的积累，通过反馈机制使转基因编码序列甲基化[22]。由此可见，强启动子或转基因重复序列的出现可能引起异常RNA和相应的cRNA产生而导致PTGS。第17页/共21页第十七页，共22页。PTGS起初发现是转基因与内源同源基因之间的相互协同抑制，这是一种转录后反式失活，被称为“共抑制”（co-suppression）[17]。共抑制现象不能被认为是进入内源基因组的转基因的单向沉默效应，而应该看作是内源基因和转基因之间的相互协调作用。在转基因植株体内，内源基因和转基因能合作产生异常RNA或cRNA。当其含量超过阈值时，激活mRNA的降解机制[11]，它与顺式失活类似，也有基因的剂量效应[8]。第18页/共21页第十八页，共22页。综上所述，基因沉默可能来源于转基因植株体内的不同核酸之间的相互作用，即DNA—DNA、DNA—RNA、RNA—RNA的非正常配对作用而导致基因核苷酸的甲基化作用和mRNA的降解，从而引发基因沉默。基因沉默可能是植物防御机制的一种自然现象——在DNA或RNA水平上抵御外源DNA，就象植物体内的对细菌、病毒的天然抗性一样[11]。这一现象给转基因工作者提出了新的难题，它已经成为转基因技术的严重障碍。它要求我们不断去探索、改进植物转基因技术，做到转基因定点、定量转化重要农作物，并得以稳定、高效表达，从而加速转基因技术在农业生产中