研究生分子医学技能实验四

实验七：乙肝病毒PCR及电泳检测第1页/共22页第一页，共23页。实验分组，认清试剂（每组做一阳性管，其它人做患者血清）

患者血清40l+40lDNA提取液，混匀

沸水浴10min，10000rpm×5min（离心机的使用）

取上清2l（或阳性血清2l）加入一PCR反应管6000rpm×5s，混匀一、实验操作及注意事项第2页/共22页第二页，共23页。93℃×3min预变性(HemaPCR仪的使用与程序设计)

93℃×45s，55℃×35s，72℃×60s

重复25个循环

72℃保温5min，-20℃保存备用琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%倒胶3mm、凝固后拔梳）第3页/共22页第三页，共23页。倒缓冲液，加样电泳（方向、电压、时间）

染色与检测（EB10min，紫外检测）第4页/共22页第四页，共23页。此步注意事项：1.每次加样要换Tip头，以防试剂的互相污染，尤其不要污染DNA聚合酶。

2.按顺序加样。

3.加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。

4.加完试剂后将PCR反应管弹匀，离心将液体汇集管底。

5.对没有热敏盖的PCR仪要加封石蜡油。第5页/共22页第五页，共23页。二、PCR基本原理及相关知识概念聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片断的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。第6页/共22页第六页，共23页。KaryMullisPCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室KaryMullis及同事于1985年发现并研制成功的。KaryMullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。

第7页/共22页第七页，共23页。

相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。第8页/共22页第八页，共23页。PCR扩增DNA片段的原理

PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：变性：加热，模板DNA形成两条单链退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3'-端向前延伸，合成与模板配对的新链第9页/共22页第九页，共23页。

上述三步为一个循环，经过一个循环DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DNA就可以扩增106~109倍。通过循环可以提高PCR的特异性。第10页/共22页第十页，共23页。第11页/共22页第十一页，共23页。PCR反应体系的组成及功能

PCR的完成是在一个0.5ml的EP管中完成，一个完整的PCR反应体系应包括以下成分：引物：是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素，合理正确的引物设计可以提高扩增的效率与特异性。终浓度为0.1~0.5umol/L；浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。第12页/共22页第十二页，共23页。

TaqDNA聚合酶有良好的热稳定性，具有5‘-3’聚合酶活性，但无3’→5’外切核酸酶校正活性，无法校正DNA合成过程中产生的错配。其活性对Mg2+浓度非常敏感终浓度一般为：2.5u/100ul第13页/共22页第十三页，共23页。

模板DNA

相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。模板用量也是很低的，一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。

第14页/共22页第十四页，共23页。dNTP：已有商品化的混合液，终浓度一般为20~200umol/L。在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。第15页/共22页第十五页，共23页。10×PCR反应buffer：已作成商品化的产品，它包括：

250~500mmol/LKCl；

100~500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；15~20mmol/LMgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5~2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）；

0.1%明胶或牛血清白蛋白第16页/共22页第十六页，共23页。ddH2O调节反应体积液体石蜡油第17页/共22页第十七页，共23页。

影响PCR的主要因素①

PCR反应体系的各个组分②

PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）③

PCR循环的次数和平台效应④

操作环境

第18页/共22页第十八页，共23页。平台效应及其原因第19页/共22页第十九页，共23页。三、结果分析与问题讨论第20页/共22页第二十页，共23页。谢谢！第21页/共22页第二十一页，共23页。谢谢您的观看！第22页/共22页第二十二页，共23页。内容总结实验七：乙肝病