无病毒苗的培育

无病毒苗的培育第一页，共七十一页，2022年，8月28日主要内容果树病毒的特点培育无病毒苗的意义培育无病毒苗的方法（脱毒方法）无病毒苗的鉴定方法无病毒苗的扩大繁殖第二页，共七十一页，2022年，8月28日前言无性繁殖植物易感染病毒植物感染病毒呈增多趋势受病毒侵染的植株生长迟缓、产量下降、品质变劣第三页，共七十一页，2022年，8月28日前言大部分病毒不能通过种子传播，但对一些园艺植物，种子繁殖易产生变异；有些植物可以用种子进行繁殖，但主要以无性繁殖为主马铃薯、大蒜、甘薯等第四页，共七十一页，2022年，8月28日病毒virus（8）病毒virus类病毒viroid类细菌BLO螺原体spiroplasma植原体phytoplasma类菌原体MLO卫星病毒satellite类立克次氏体RLO第五页，共七十一页，2022年，8月28日一、果树病毒病特点果树多年生，营养繁殖或嫁接繁殖为主，会导致病毒侵染逐年积累增多。一旦染毒，终生带毒，持久受害。嫁接是果树传播的主要途径。难以应用化学药剂或生物制品进行有效的防治。系统侵染，染毒后，植株各部位均带毒。第六页，共七十一页，2022年，8月28日世界各地报道的主要果树病毒种类数（1997）树种病毒及类似病害类病毒卫星病毒植原体螺原体小计仁果类69204075苹果40103044梨21101023温勃700007山楂100001核果类115010101162桃35104141李31001022杏18002020樱桃66002068枣000101第七页，共七十一页，2022年，8月28日世界各地报道的主要果树病毒种类数（1997）树种病毒及类似病害类病毒卫星病毒植原体螺原体小计浆果类59234270葡萄37222144草莓22012025柿000011坚果类600208板栗100102核桃500106合计2845323315第八页，共七十一页，2022年，8月28日病毒病害举例草莓：使日本草莓产量严重减产，几乎遭受灭顶之灾CTV：曾毁灭巴西大部分柑桔园，圣保罗州80%甜橙因病毒病死亡；美国、阿根廷、委内瑞那等也遭受重创观赏植物病毒病造成观赏价值下降。第九页，共七十一页，2022年，8月28日获得无病毒苗获得无病毒苗获得无病毒苗获得无病毒苗第十页，共七十一页，2022年，8月28日无病毒苗Virus-freeseedlingsVirus-detectedseedlings第十一页，共七十一页，2022年，8月28日二、无病毒苗的特点（4）1、无病毒苗木根系发达，生长健壮，整齐一致，结果早；草莓无病毒苗草莓有病毒苗第十二页，共七十一页，2022年，8月28日苹果无病毒苗苹果有病毒苗第十三页，共七十一页，2022年，8月28日无病毒苗的特点无病毒苗木根系发达，生长健壮，整齐一致，结果早；2、无病毒果树树势强，稳妥高产，一般增产40%以上第十四页，共七十一页，2022年，8月28日无病毒苗的特点无病毒苗木根系发达，生长健壮，整齐一致，结果早；无病毒果树树势强，稳妥高产，一般增产40%以上3、果个大，果面光洁度好，果品质量显著提高第十五页，共七十一页，2022年，8月28日无病毒苗的特点无病毒苗木根系发达，生长健壮，整齐一致，结果早；无病毒果树树势强，稳妥高产，一般增产40%以上果个大，果面光洁度好，果品质量显著提高4、需肥量少，抗逆性强第十六页，共七十一页，2022年，8月28日三、培育无病毒苗的意义从根本上消除只靠种苗传播的病毒病的危害。无病毒栽培可充分利用优良砧木，改善果树品质，提高丰产性、抗逆性及利用砧木的其化优良必状，而不要考虑砧木对某些病害的敏感性无病毒苗可以减少农药的使用，降低生产成本，减少农药残留，避免对环境的污染第十七页，共七十一页，2022年，8月28日四、脱毒方法（7）热处理茎尖培养愈伤组织培养茎尖微体嫁接珠心胚培养花药培养脱毒法热处理和茎尖培养结合法第十八页，共七十一页，2022年，8月28日1、热处理脱毒原理研究简况热处理方法不足第十九页，共七十一页，2022年，8月28日1.1热处理脱毒原理病毒和寄主细胞对高温的忍耐程度不同，选择适当的温度和处理时间，就能使寄主体内病毒的浓度降低，运行速度减慢或失活，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长，在生长点附近有可能脱除病毒，从而达到脱毒的目的。菊花和番茄在35-36ºC时栽培2个月，可除去菊花萎缩类病毒和番茄不孕病毒香石竹在40ºC栽培1-2个月可除去某些病毒。第二十页，共七十一页，2022年，8月28日1.2热处理的研究1889年：印度尼西亚人发现患枯萎病的甘蔗放在50-52的热水中30分钟，可去除枯萎病1936年Kunkel报道患有桃黄萎病的植株，在34-36温度下处理2周，可使病毒失去活性。第二十一页，共七十一页，2022年，8月28日果树热处理脱除病毒的种类果树病毒种类温度时间脱毒难易柑桔CTV3928天易CEV3833周很难脉突病毒40/308周难碎叶病毒40/30+44/306+2周难苹果褪绿叶斑病毒3720天易茎痘病毒3720天易花叶病毒372-3周易梨环纹花叶病毒3720天易梨脉黄化病毒363周易第二十二页，共七十一页，2022年，8月28日果树热处理脱除病毒的种类果树病毒种类温度时间脱毒难易核果类李属坏死环斑病毒3817天

易李痘病毒3714-21天

易李矮缩病毒3817天

易樱桃绿化环斑病毒3814天易桃X病37.53周易桃黄化病3514天易樱桃绿化斑驳病毒386周难李线纹斑病毒3721-28天易葡萄扇叶病毒358周易卷叶病毒3821天难栓皮病毒3814天很难第二十三页，共七十一页，2022年，8月28日1.3植物生长区与热处理区关系温度生长量热处理区病原菌被消除寄主被杀死第二十四页，共七十一页，2022年，8月28日1.4热处理方法温水浸渍热空气处理第二十五页，共七十一页，2022年，8月28日苹果热处理方法盆栽脱毒材料的准备在4-5月间果树发芽前，用切接法将带毒接穗接在盆栽实生砧上，或于8-9月用芽接法在每盆砧木上接2-3个病芽。次年将接苗剪至20cm左右，留3-5个芽高温空气处理待苗木长出3-5片叶时，放入热处理箱或室内，首先在25-30ºC处理1-2周，然后转至37±1ºC处理30天左右嫩芽嫁接热处理28天后，处理苗长出长约15-25cm的新梢，用发片切取新梢顶端0.5-1cm的顶芽，皮下嫁接到预先盆栽的实生砧上，再套上塑料袋，鉴定第二十六页，共七十一页，2022年，8月28日病芽嫁接热处理嫩芽嫁接鉴定获得无病毒苗第二十七页，共七十一页，2022年，8月28日1.5热处理的不足之处不能排除所有病毒，而且处理效果不一康乃馨花叶病毒在38处理要2个月，用40高温处理枝条，顶部病毒虽有减少，但基部病毒仍然很多马铃薯热处理后，块茎品质降低，块茎颜色改变，推迟发芽或完全不发芽。热处理对部分球状病毒（葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒）或线状病毒（马铃薯X、Y病毒、苹果褪绿叶斑病毒）有效，而对杆状病毒则不起作用第二十八页，共七十一页，2022年，8月28日2.茎尖培养脱毒原理研究简况脱毒程序已脱毒植物影响因素第二十九页，共七十一页，2022年，8月28日2.1茎尖培养脱毒原理病毒在植物体内的布不均匀，顶端分生组织无病毒或病毒浓度低。在生长点含有病毒数量极少，几乎检测不出病毒传递途径：维管束和胞间连丝在分生区域内无维管束；在胞间连丝中，病毒移动速度慢于不断分裂和活跃的细胞，从而在分生组织中，病毒移动和复制受阻。第三十页，共七十一页，2022年，8月28日2.2茎尖培养脱毒研究简况1943年：White培养番茄根，发被烟草花叶病毒侵染的番茄根切段的病毒含量不一致，在近根尖的切段低，而在根尖顶端则全部无病毒1948-1949年：Holmes和Masset等发现，由病毒感染的植株，不同部位病毒分布不一致。在老叶和成熟的组织及其器官中含量高，而幼嫩的和未成熟组织及其器官中含量低，在生长点0.1-1mm区域，则几乎不含病毒。1952年：Mores等从感染花叶病毒的大丽花植株分离了茎尖0.25mm大小的分生组织培养获得植株，嫁接在大丽花实生砧木上，经检测为无病毒植株。1955年：Mores以马铃薯为材料，也获得了无病毒种苗已有近100种园艺植物通过茎尖培养方法获得无病毒苗第三十一页，共七十一页，2022年，8月28日2.3茎尖培养获得的无病毒植物植物种类病毒茎尖大小甘薯斑纹花叶病毒1-2缩叶花叶病毒1-2羽毛状花叶病毒0.3-1马铃薯Y病毒1-3X病毒0.2-0.5卷叶病毒1-3G病毒0.2-0.3S病毒0.2大丽菊花叶病毒0.6-1第三十二页，共七十一页，2022年，8月28日茎尖培养获得的无病毒植物（续）植物种类病毒茎尖大小香石竹花叶病毒0.2-0.8百合花叶病毒0.2-1大蒜花叶病毒0.3-1矮牵牛烟草花叶病毒0.1-0.3菊花花叶病毒0.2-草莓各种病毒0.2-1甘蔗花叶病毒0.7-0.8春山芥芜青花叶病毒0.5第三十三页，共七十一页，2022年，8月28日2.4茎尖培养脱毒程序材料的选择取出茎尖培养再生第三十四页，共七十一页，2022年，8月28日2.4.1材料的选择品种要可靠选择高产优质的品种作为脱毒材料名贵稀有的植物良种第三十五页，共七十一页，2022年，8月28日2.4.2茎尖的剥取剥去生长点（锥）外围的幼叶和叶原基，露出圆滑的生长锥。剥取茎尖时：迅速（防污染），准确（防损伤生长锥），用显微镱第三十六页，共七十一页，2022年，8月28日茎尖形状、大小和外围幼叶、叶原基着生方式草莓大蒜兰花青芋山芋香石竹第三十七页，共七十一页，2022年，8月28日第三十八页，共七十一页，2022年，8月28日2.5影响茎尖成活及脱毒效果的因素3（1）茎尖大小大，容易成活，获得植株多，但病毒难以除去P121香石竹不同大小茎尖培养与脱毒率的关系茎尖太大不易脱除病毒康乃馨0.1mm和1mm茎尖脱除病毒的效率分别为66%和10%不同植物脱毒茎尖大小不一，康乃馨、百合、鸢尾、菊花和草莓脱除花叶病时：0.2-1mm大丽花脱除花叶病毒：0.6-1mmmm不同病毒种类要求茎尖大小不一样马铃薯Y病毒和卷叶病毒，脱毒茎尖大小为1-3mmG和Xmm；S病毒0.2mm（2）叶原基有无：有则难于脱毒第三十九页，共七十一页，2022年，8月28日影响茎尖成活及脱毒效果的因素（3）培养基基本培养基生长调节剂：有机物质：碳源：葡萄糖和蔗糖，浓度2%-4%第四十页，共七十一页，2022年，8月28日3.茎尖微芽嫁接Shoottipgrafting,micrograftingmm的茎尖作为接穗，在解剖镜下嫁接到试管实生苗上，获得完整植株的操作过程。1975年在柑桔上取得成功，现在苹果、桃、梨上获得成功。第四十一页，共七十一页，2022年，8月28日3.1意义培育无病毒苗解决常规培养不能再生根的问题提早开花结果第四十二页，共七十一页，2022年，8月28日3.2方法田间材料取茎尖种子播种获得黄化苗嫁接消毒取小茎尖培养再生移栽第四十三页，共七十一页，2022年，8月28日图解第四十四页，共七十一页，2022年，8月28日4.种子或胚心胚培养脱毒法脱毒原理：珠心与维管束系统无真接联系成功的实例1969年：美Rangan培养授粉后100天左右的柚、Temple珠心组织，获得无病毒苗1973年：西班牙Sicilia播种带病毒甜橙种子得到避毒系1977年：美Button培养华盛顿脐橙珠心组织获得无病毒苗1979年：西班牙Navarro克里迈丁桔无病毒珠心苗1990年：高峰柑桔未授精胚珠离体培养获得华脐无病毒苗第四十五页，共七十一页，2022年，8月28日5.愈伤组织培养脱毒法P126（自学）第四十六页，共七十一页，2022年，8月28日6.花药培养脱毒法1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；花药采取时期单核期：花蕾4-6mm，花药1mm花药诱导愈伤组织培养基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L增殖培养基MS+GA1mg/L+IBA0.2-0.5mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L生根培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L第四十七页，共七十一页，2022年，8月28日7.热处理和茎尖脱毒法马铃薯苹果第四十八页，共七十一页，2022年，8月28日五、脱毒苗的鉴定直观测定法指示植物鉴定法病毒的汁液感染法(saptransmission)抗血清测验法电镜观察法第四十九页，共七十一页，2022年，8月28日1、直观测定法时间长敏感度不够杏红斑病香蕉束顶病第五十页，共七十一页，2022年，8月28日2、指示植物法1929年美国病毒学家Holmes发现利用病毒在植物上产生枯斑来鉴定病毒的一种方法。有些病毒可能在一种或几种植物上产生枯斑，便有一种或几种指示植物鉴定同一种病毒。指示植物是指对某种或某几种病毒及类似病原物或株系有敏感反应，并表现明显症状的植物。第五十一页，共七十一页，2022年，8月28日（1）指示植物法的意义确认一种病毒类病原物在症状不明显或不确定的植株中存在；用于检测隐形病毒的存在或某些品种的隐形病毒，确定无病症的植株上是否存在病毒；标记病毒复合物的存在以及鉴定病毒。第五十二页，共七十一页，2022年，8月28日（2）指示植物的要求指示植物对所指示的病毒类病原物敏感指示植物对所指示的病毒类病原物专一表现症状快易于繁殖第五十三页，共七十一页，2022年，8月28日指示植物（仁果）树种木本指示植物嫁接株数鉴定时间（年）病毒种类苹果大果海棠32褪绿叶斑病毒、鳞皮病毒、矮缩病毒弗吉尼亚小苹果33茎痘病毒、茎沟病毒、反卷病毒苏俄苹果32褪绿叶斑病毒梨杂种温勃32脉黄病毒、衰退病、树皮坏死病哈代32环纹花叶病毒、脉黄病毒、裂皮病、树皮坏死病威谦斯姆32粗皮病、裂皮病第五十四页，共七十一页，2022年，8月28日指示植物（核果）树种木本指示植物嫁接株数鉴定时间（年）病毒种类桃萨姆32坏死锈斑驳病毒钛尔顿33樱桃扭叶病毒青肤樱32绿环斑驳李樱桃李32美洲线纹斑病毒杏青肤樱32绿环斑驳病毒樱桃青肤樱56周-1年绿环斑驳病毒第五十五页，共七十一页，2022年，8月28日常用草本指示植物藜科：昆诺藜、苋色藜、墙生藜等；豆科：菜豆茄科：心叶烟、克利夫兰烟苋科：千日红、青葙葫芦科：黄瓜第五十六页，共七十一页，2022年，8月28日葡萄卷叶病指示植物—丽株—叶片反卷、红叶第五十七页，共七十一页，2022年，8月28日苹果茎痘病指示植物—司派—叶片反卷第五十八页，共七十一页，2022年，8月28日苹果褪绿叶斑病指示植物西方烟（叶雏缩）苋色藜（坏死斑）第五十九页，共七十一页，2022年，8月28日（3）指示植物法的类型分为两种汁液鉴定法（草本指示植物法）嫁接鉴定法（木本指示植物法）第六十页，共七十一页，2022年，8月28日I、汁液鉴定法脱毒处理再生植株幼叶1-3克在研钵中加10ml水及少量磷酸缓冲液（0.1M，pH7），研磨过滤在指示植物叶片上产生小伤口滤液在叶片伤口涂抹2-3次清水冲洗，15-25保温2-6天产生病斑，（）脱毒不产生病斑，（）脱毒第六十一页，共七十一页，2022年，8月28日II、嫁接鉴定法双重芽接法在8月中旬进行砧木脱毒苗芽指示植物芽指示植物芽脱毒芽实生砧木双重切接法在春季进行指示植物直接嫁接法第六十二页，共七十一页，2022年，8月28日4、抗血清（antiserum）测验法病毒在肌体内产生抗体，抗体主要存在于血清中，故名曰抗血清。不同病毒产生的抗血清不同，因此可以用已知病毒的抗血清，鉴定未知的病毒种类，即血清反应法。第六十三页，共七十一页，2022年，8月28日血清学方法沉淀反应凝聚反应荧光抗体法单克隆抗体法酶