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文档简介

从鸡蛋清中制备溶菌酶实验指导书一、实验目的法。二、实验原理溶菌酶（E.C.3.2.1.7）是糖苷水解酶，由129个氨基酸残基组成，在蛋清中其含量丰富，从一个鸡蛋中可获得20mg左右的冻干酶。在蛋清中除溶菌酶以外还有其它许多蛋白质，但溶菌酶有两个显著的特点：一是具有很高的等电点，PI=11.0，二是其分子量低，Mr=14.6×103，借此可以将它从蛋清中很容易地分离出来。图：细胞壁的量表示酶活力的大小。三、实验材料、试剂和仪器鸡蛋；微球菌（s；0.1mol/L-H缓冲液(pH10.0)；含0.1mol/Ll0.1mol/L-H缓冲液(pH10.0)0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.2；M纤维素；y试剂；小层析柱（1×15c；常规玻仪。四、实验内容1、从鸡蛋清中分离溶菌酶20mL0.1mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.0)稀释5（1）12只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中（出蛋清即可（pHpH8.0，否则不能用，慢慢搅拌几分钟，然后用纱布过滤以去除卵带或碎蛋壳，量出蛋清体积并记录。说明。2、溶菌酶的分析蛋白质含量的测定，可按Lowry可采用紫外法，但因为溶菌酶中的色氨酸相对含量高且分子量小，故溶菌酶的10% 10%E =26.4，而BSA的E =6.2，因此在用280nm测定时，溶菌酶对标准牛血清280 280白蛋白来说应有一个系数4。溶菌酶活力测定：取干菌粉（M.Lysodeikticus）0.1mol/L磷酸缓冲液配制pH6.2，以20mg干粉L为宜，此时悬浮液的光密度值应在范围内.取干酶粉用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.24)配成1mg/mL。将酶液和底物悬液分别置于25℃水浴中保温10~15分钟，然后吸取底物浮液3mL 置比色杯中，比色测定 A450，此时为零时读数。然后加入酶液0.2mL(10μg酶)，迅速摇匀，从加入酶液起计时，每隔30秒测一次A450，共测次（90秒。4500.001为一活力单位25℃，pH6.。SDS法。五、结果处理组分组分蛋白质（mg）酶活力（单位）回收率（%）比活力FF1F2F3F4总回收量起始总量（F）0回收率（%）附：艳红K-2BP标记溶性微球菌M.lysodeikticus的制备1Micrococcuslysodeikticus634，接种于肉汤培（0.51.0%2.5pH7.5103.4Kp，灭菌15分钟37℃培养48~722K-2BPM.lysodeikticus5g501.25mol/LNaOH2.5上海染化入厂生产）搅2524小时进行染色后，3000r/min10分钟收集红色711树脂在搅拌下进行处理（型，pH7，树脂50倍磷酸盐缓冲液内，1%底物溶液。或者将染色菌体冻干

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