DB15-T 2833-2022 狼源性成分检测 实时荧光PCR法

DB15/T

2833—2022

PCR

1 范围本文件规定了动物源性产品中狼源性成分实时荧光检测方法。L。2规范性引用文件文件。GB/T

6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T

27403 实验室质量控制规范

食品分子生物学检测3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。实时荧光 PCR

real-time

PCR在PCR反应体系中加入荧光基团,

利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct

值 cycle

threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyl

trithyl

ammonium

bromide)DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic

acid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene

acid)FAM:6-羧基荧光素PCR:聚合酶链式反应（

chain

reaction）TAMRA:

羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]5 试剂与材料DB15/T

2833—2022水：符合

GB/T

6682

的要求。引物对序列:a)

上游：5′b)

下游：5′c)

探针序列：5′

TACCTCACATTAGCCAAGAAGCCA

-(TAMRA)-3′。DNA

提取试剂盒。CTAB。Tris-HCl

)。NaCl。EDTA。蛋白酶

K

溶液

。三氯甲烷。异丙醇。75%乙醇。实时荧光

预混液。阳性对照样品：采用已知含有狼源性成分样品的

，或经测序确认的阳性质粒。见附录

B。阴性对照样品：采用已知不含有狼（包括其他犬科动物）源性成分样品的

。空白对照：ddH2O。6 仪器与设备实时荧光

仪（加热速率

10

℃/s

以上）。高速台式离心机（最高转速

12000

旋涡振荡器（最高转速

rpm）。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水浴锅。天平（感量

0.01

g）。单孔道微量移液器：0.5

L～10

L、10

L～

L、20

L～

L、

L～1000

L。7 实验方法DNA

参照附录A中提取样品DNA的方法提取，也可采用等效商品化的组织基因组提取试剂盒进行。当DNA浓度吸光度值A260/A在1.7～PCR阳性及空白提取对照。实时荧光

7.2.1反应体系反应体系体积为25.0

L，见表1。mol/L

12.510.01.010.01.010.01.02.0ddH2O

25.0DB15/T

2833—2022表1狼源性成分实时荧光

PCR

检测方法的反应体系检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。7.2.2 反应条件预变性：94

℃，3

min

94

℃，10

s60

℃，

s，35个循环。在

℃时收集荧光信号值。8 结果判定与表述质量控制质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：a)

空白对照：无荧光对数增长，相应的

Ct

值大于等于

35.0；b)

阴性对照：无荧光对数增长，相应的

Ct

值大于等于

35.0；c)

阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的

Ct

值小于等于

28.0。结果判定8.2.1 质控对照成立条件下，2

个平行样检测结果

28.0，可判定被检样品为阴性。8.2.2 质控对照成立条件下，2

个平行样检测结果

28.0，可判定被检样品为阳性。8.2.3 质控对照成立条件下，至少

1

个平行样检测结果

值

28.0～35.0，并出现典型的扩增曲线，此时应适当增加

DNA

模板量重做实时荧光

PCR

Ct

值小于等于

28.0型的扩增曲线，可判定被检样品为阳性；再次检测结果

值大于

28.0，可判定被检样品为阴性。结果表述8.3.1 结果为阳性者，表述为“检出狼源性成分”。8.3.2 结果为阴性者，表述为“未检出狼源性成分”。9 防止交叉污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T

27403中的规定执行。DB15/T

2833—2022

附 录 A（资料性）溶液配制及提取方法A.1 CTAB-提取缓冲液将5

g

CTAB，20.45

g

NaCl，3.03

g

Tris，1.86

g

Na2-EDTA溶于200

mL水中，用盐酸调pH

后，定容至250

mL，115

℃高压15

。A.2 CTAB-沉淀液称0.2

g

CTAB,0.234

g

，定容至100

mL，115

℃高压15

。A.3 1.2

mol/L

NaCl

溶液：称取28

g

NaCl，定容至

mL，115

℃高压15

min。A.4 DNA

提取方法：A.4.1 称取样品

g～1

g加入

mL～3.5

mL

CTAB12

L～20

L蛋白酶K（根据CTAB265

℃至少1

h(过夜孵育最好)样品膨胀，则可再多加每次多1

mL，最多10

。A.4.2 4000

～5000

离心

。A.4.3 将上清（约1

mL）加入无菌EP2

mL

L氯仿，涡旋30

s12000

10

min。A.4.4 取上清600

L～

L加入无菌EP2倍体积的CTAB1min。A.4.5 12000

rpm离心

L的1.2

mol/L

NaCl溶液。（2管合并共用350L溶液）。A.4.6 加入

L氯仿，涡旋30

min，

12000

10

。A.4.7 取上清液至无菌EP0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20

min，12000

rpm离心

，去上清，沉淀用

L

75%的乙醇洗涤，再12000

rpm10

min。A.4.8 去上清后，干燥沉淀，60

℃下15

s～20

sA.4.9 将沉淀溶于100

L灭菌水或TE

或DEPC水中。DB15/T

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