第十章遗传重组要详解演示文稿

第十章遗传重组要详解演示文稿第一页，共七十页。优选第十章遗传重组要第二页，共七十页。第三页，共七十页。第四页，共七十页。遗传重组的证明第五页，共七十页。突变和重组是提供进化起始物质的两个过程。突变引起的遗传改变能引起蛋白质中氨基酸序列的变化，该变化引起表型的改变，通过自然选择发生作用。重组提供一个基因组结构的变化，也会引起表型的变化，也通过自然选择发挥作用。第六页，共七十页。根据不同的机制，可将重组分成4类：同源性重组（homologousrecombination）位点特异性重组（site-specificrecombination）转座重组（transpositionrecombination）异常重组（illegitimaterecombination)第七页，共七十页。第一节同源性重组同源性重组是发生在两个DNA分子同源区之间的重组。同源性重组主要是利用DNA序列的同源性识别重组对象，由碱基序列提供识别的特异性。同源性重组最主要特征是相关的酶可以利用任何一对同源序列为底物。第八页，共七十页。真核生物减数分裂时的染色体之间的交换，某些低等真核生物及细菌的转化、转导、接合，噬菌体的整合等都属于同源性重组这一类型。在整个基因组中，同源重组的频率并不恒定，并且跟染色体的结构有关。例如在异染色体附近遗传物质的交换要受到抑制。第九页，共七十页。一、进行同源重组的基本条件（1）在交换区具有相同或相似的序列发生同源性重组的两个区域的核苷酸序列必须是相同或非常相似的。同源性重组常常只发生在两个DNA分子中的相同部位。第十页，共七十页。（2）双链DNA分子之间互补碱基进行配对两个DNA分子的链之间互补的碱基配对确保重组只发生在同样的基因座之间。在该部位两个双链DNA分子通过链之间互补的碱基配对被维系在一起称为联会。第十一页，共七十页。（3）重组酶参与重组反应的酶保证重组的顺利进行。重组过程中，每个分子的链首先断裂，然后进行修复和连接，两个DNA分子之间发生交换。重组完成后，重组分子的解离和释放等过程均是在酶催化下进行的。第十二页，共七十页。（4）异源双链区的形成同源性重组时，在两个DNA分子之间互补碱基配对的区域称为异源双链区（heteroduplexregion）。两个DNA分子通过一段异源DNA双螺旋共价相互连接。第十三页，共七十页。第十四页，共七十页。第十五页，共七十页。二、同源性重组的分子模型第一个被广泛接受的重组模型是1964年由RobinHolliday提出的Holliday模型。即将发生重组的两个DNA分子同一个部位的两个单链的断裂，从而引发重组。两个断裂单链的游离端彼此交换，形成两个异源双链，然后末端连接形成Holliday连接体（HollidayJunction）。第十六页，共七十页。第十七页，共七十页。一旦Holliday连接体形成后，它能进行重排从而改变链的彼此关系。这种重排称为异构化，因为在此过程中没有键的割裂。一旦形成Holliday连接体后，就能被拆分。是否发生重组依赖于拆分时Holliday连接体的构象。第十八页，共七十页。第十九页，共七十页。第二十页，共七十页。第二十一页，共七十页。第二十二页，共七十页。Holliday模型被称为双链侵入模型，因为由于每一个DNA分子的一条链侵入到另一个DNA分子，它解释了在重组时两个DNA分子的异源双链是如何形成的。Holliday连接体也能通过碱基之间氢键的断裂和再连接而发生左右移动。这个过程称为支链迁移（branchmigration)第二十三页，共七十页。第二十四页，共七十页。Holliday认为在DNA分子上存在某些位点，特殊的引发重组的酶能够识别这些位点，确保两条链在相同的部位被切断。目前还没有足够的证据证明这些位点的存在。第二十五页，共七十页。单链侵入模型单链侵入模型是对Holliday模型的修改。在该模型中，两个DNA分子中的一个单链在随机部位被切断，然后暴露的末端侵入到另一个双链DNA分子，发现它的互补序列以后将替代与它相同的链。然后DNA聚合酶将用留下的那条链作为模板，填充上侵入链所留下的缺口。被替代的链被降解，它的残留末端与另一分子中新合成的DNA链相连接形成Holliday连接体。第二十六页，共七十页。第二十七页，共七十页。Holliday连接体形成以后，就会产生异构化然后拆分。单链侵入模型中，异源双链首先只在两个DNA分子中的一个形成。Holliday中间体形成以后通过支链迁移能够在另一个DNA分子上产生异源双链，这样就解释了异源双链是如何形成的。第二十八页，共七十页。第二十九页，共七十页。双链断裂修复模型目前证明通过两个DNA分子之中的一个双链断裂引发重组是个常见的机制。该模型认为参与重组的两个DNA分子之一的两条链被核酸内切酶切断，然后在核酸外切酶作用下产生3’单链黏性末端。两个3’游离末端之一侵入到另一个双螺旋的同源区，置换“供体”双螺旋的一个单链而形成一段异源双链DNA，并同时产生一个D环（D-loop）。第三十页，共七十页。第三十一页，共七十页。第三十二页，共七十页。第三十三页，共七十页。第三十四页，共七十页。D环在DNA聚合酶的作用下修补而扩展，直至D环的长度与“受体”DNA双螺旋缺口长度相当，互补的两条单链退火。此时在缺口的两侧各有一段异源双链DNA，两个杂合双螺旋之间为断裂的缺口，并且此缺口为供体DNA序列所填充。缺口处双链的完整性可以被以缺口3’端为起始的修补合成来修复。缺口是被两次单链DNA的合成而修复的。第三十五页，共七十页。第三十六页，共七十页。第三十七页，共七十页。第三节大肠杆菌重组的分子基础在分子水平上，重组事件发生的先后顺序是相似的：从一个已断裂的分子中产生的单链与其对应的双螺旋发生作用，配对区间扩展，重组中间体形成直到核酸内切酶解离此两个双螺旋分子。识别反应是重组机制的不可分割的重要部分，并且只涉及到DNA分子的特定区域而不是整个完整的染色体。第三十八页，共七十页。一、chi位点和RecBCD核酸酶在λ噬菌体的一些突变种内，存在一些称为chi的位点。chi位点单一的碱基对的改变即可激发重组的发生。这些位点皆含有一个恒定的非对称的8bp序列：5’GCTGGTGC3’3’CGACCACC5’第三十九页，共七十页。Chi位点是一个由基因recBCD编码的RecBCD酶作用的靶部位。RecBCD酶是一种多功能酶，具有几种不同的活性。它是一个强有力的降解DNA的核酸酶，早期被检定为活性核酸外切酶V，具有解旋酶的活性。RecBCD所介导的解旋和切割可以被用来产生末端，并引发异源双链的形成。第四十页，共七十页。第四十一页，共七十页。第四十二页，共七十页。第四十三页，共七十页。二、RecA和Holliday连接体的形成RecA具有两种相当不同的活性:RecA可以促进单链DNA与其在双链DNA分子中互补的DNA链的碱基相配对。RecA还可以在SOS反应中激活蛋白酶。RecA需要单链DNA和ATP才能激活蛋白酶。第四十四页，共七十页。RecA能够利用由RecBCD在Chi位点附近切割所释放的单链3’末端。RecA的DNA操作酶活性可以使一个单链DNA与双螺.旋中的同源序列发生置换，这一反应被称为单链摄取(single-stranduptake)或单链同化(single-strandassimilation)。第四十五页，共七十页。第四十六页，共七十页。第四十七页，共七十页。第四十八页，共七十页。三、Ruv蛋白和Holliday连接体的拆分大肠杆菌有一组由三个基因编码与随后的重组相关联的蛋白。ruvA和ruvB基因的产物促进异源双链的形成。RuvA蛋白可以识别Holliday连接体的结构，RuvB是一个腺苷三磷酸酶并可能提供支链迁移的动力。第四十九页，共七十页。RuvA在交叉点处与DNA所有的4条链相结合，在交叉点的上游，两个RuvB六聚体环状结构分别与每个双螺旋相结合。RuvAB蛋白复合体可以使支链以10～20bp的速度迁移。第五十页，共七十页。第五十一页，共七十页。第三个基因ruvC编码一种能够特异性地识别Holliday连接体的核酸内切酶，此酶可以在体外切断此种交叉而拆分重组中间体。一个含4个碱基的序列提供了RuvC拆分Holliday连接体的热点。这一序列决定了拆分过程中哪一对DNA链被切断，从而决定发生的是补丁型重组（patchrecombination）还是剪接型重组（splicerecombination）。第五十二页，共七十页。第五十三页，共七十页。第五十四页，共七十页。第五十五页，共七十页。第四节位点特异性重组位点特异性重组发生在特殊序列对之间，这一重组型式最早是在λ噬菌体的遗传学研究中发现的。λ噬菌体有两种存在型式：裂解状态和溶源状态。两种类型间的转换是通过位点特异性重组实现的。第五十六页，共七十页。一、λ噬菌体DNA的整合与切除为了进入溶源状态，游离的DNA必须整合（intergrate）到细菌DNA中去；而为了从溶源状态向裂解状态转化，原噬菌体DNA则必须从细菌染色体DNA上切除（excise）。整合和切除均通过细菌DNA和λDNA上特定位点—附着点（attachmentsite，att）之间的重组而实现。第五十七页，共七十页。细菌染色体上的附着点（attλ）称为attB，含有B、O、和B’三个序列（BOB’）。突变后可以阻止λDNA的整合。λ噬菌体的附着位点称attP，由P、O和P’三个序列组成。其中O序列是attB和attP所共有的，序列完全一致，称核心序列（coresequence）.是位点特异性重组发生的地方。第五十八页，共七十页。第五十九页，共七十页。整合反应由λ噬菌体int基因的产物整合酶（integrase,Int）催化。Int是一种DNA结合蛋白，对POP’序列有强的亲和力。整合反应还需要一种有大肠杆菌编码的一种细菌蛋白，称为整合宿主因子IHF(integrationhostfactor,IHF)。Int和IHF可以在体外进行位点特异性重组。第六十页，共七十页。第六十一页，共七十页。切除反应发生在原噬菌体两端的attL和attR之间，产物为λ噬菌体环状DNA和细菌染色体DNA。催化切除反应的除了Int和IHF外，还需要一种叫做切除酶（exicisionase,Xis）的蛋白参加，该酶由λ噬菌体的cis基因编码。Xis对控制反应方向起重要作用，它是切除反应所需要的，但却抑制整合反应。第六十二页，共七十页。整合和切除反应所需要识别的序列对不相同。整合要求对attB和attP之间进行识别，但切除要求对attL和attR识别。因此位点特异性重组的方向性特征由重组位点的特征所控制。整合和切除反应皆需Int和IHF蛋白。第六十三页，共七十页。λ噬菌体DNA的整合机制

λDNA的整合涉及到attB和attP的核心序列DNA链的割裂和重接。首先在attB和attP位点上产生同样的交错切口，形成了5’-OH和3’-P的末端。5’单链区全长7个碱基。两个核心区的断裂完全相同，连接过程不需要任何新DNA的合成。在整合反应中，互补的单链末端交互杂和，连接并完成整合过程。第六十四页，共七十页。第六十五页，共七十页。第六十六页，共七十页。第六十七页，共七十页。整个反应中没有可以自由旋转的中间体。断裂和重新结合反应与拓扑异构酶I催化的反应机制相类似，不同的是相互连接的两条链不是来自于同一双螺旋，而是来自于不同的双螺旋。第六十八页，共七十页。第六节异常重组异常