第四章动物细胞工程制药演示文稿

第四章动物细胞工程制药演示文稿第一页，共七十五页。优选第四章动物细胞工程制药第二页，共七十五页。1665年RobertHook发现软木塞中蜂窝状小室（cell）1667年荷兰科学家Leeuwenhoek观察到真正的活细胞1838～1839年德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann提出细胞学说第三页，共七十五页。“细胞学说”的基本内容有机体是由细胞和细胞的产物所构成的，细胞是构成有机体的基本单位。每个细胞作为一个相对独立的单位，既有它“自己的”生命,又对与其它细胞共同组成的整体的生命有所助益。新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。第四页，共七十五页。组织培养或细胞培养是将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机体体内生理条件进行培养，使之生存和生长。细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。第五页，共七十五页。细胞工程包括：真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术；细胞融合的理论和技术；细胞器特别是细胞核移植的理论和技术；染色体改造的理论和技术；转基因动、植物的理论和技术；细胞大量培养的理论和技术；将有关产物提取纯化的理论和技术。第六页，共七十五页。表1动物细胞培养的产物

疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等

动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、猪霍乱疫苗、狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂β-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素等酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶等激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等第七页，共七十五页。第二节动物细胞的形态和生理特征

一、动物细胞的形态1、动物细胞的结构细胞膜细胞质细胞核第八页，共七十五页。2、离体培养的细胞生长特性贴壁细胞如成纤维细胞，巨噬细胞，神经细胞悬浮细胞如血液白细胞，淋巴细胞等兼性贴壁细胞

如中国仓鼠卵巢细胞第九页，共七十五页。二、动物细胞的化学组成和代谢1、动物细胞的化学组成细胞中具有24种元素：对生命起着特别重要的作用——C、H、O、N、P、S细胞中少，但是必需的——Ca、K、Na、Cl、Mg、Fe其它——Mn、I、Mo、Co、Zn、Se、Cu、Cr、Sn、V、Si、F微量元素第十页，共七十五页。细胞中的化合物分为：无机物：如水、无机盐有机物：如蛋白质、核酸、脂质、糖类第十一页，共七十五页。三个阶段（书P83页图）第一阶段：大分子降解为小分子。多糖——单糖；脂肪——甘油、脂肪酸；蛋白质——氨基酸第二阶段：小分子代谢产生乙酰辅酶A、α–酮戊二酸、草酰乙酸第三阶段：三个中间产物进入“三羧酸循环”，产生生命活动必需的能量2、动物细胞的代谢第十二页，共七十五页。1、细胞的分裂周期长G1期：合成DNA聚合酶和RNA，为DNA合成做准备。S期：DNA合成G2期：DNA量加倍，RNA合成，染色体螺旋化。M期：0.5-1h，分裂形成子细胞。细胞分裂周期图三、动物细胞的生理特点第十三页，共七十五页。2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。

接触抑制：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与周围细胞互相接触时，细胞就停止增殖。若细胞转化成异倍体后，该抑制可解除第十四页，共七十五页。肿瘤细胞在生长过程中丧失接触抑制第十五页，共七十五页。细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养有限细胞系无限细胞系多数组织细胞固定在表面生长和分裂。遗传物质改变3、正常二倍体细胞的寿命是有限的。

第十六页，共七十五页。4、动物细胞对周围环境十分敏感物理化学因素，如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长，这是由于动物细胞没有细胞壁的保护，所以更敏感。5、动物细胞对培养基要求很高原核生物：只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长动物细胞：12种必需氨基酸、8种以上维生素、多种无机盐和微量元素、葡萄糖、多种细胞生长因子和贴壁因子。第十七页，共七十五页。6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同

原核生物动物细胞蛋白质的合成游离的核糖体：粗面内质网的核糖体：糖基化及一系列翻译后修饰无粗面内质网结构，因此没有糖基化及一系列翻译后修饰。第十八页，共七十五页。四、每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）第十九页，共七十五页。游离期：

细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：

细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟——4小时贴壁。

底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等

进口塑料培养瓶涂有生长基质第二十页，共七十五页。潜伏期

此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：

细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：

细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制第二十一页，共七十五页。第三节生产用动物细胞的要求和获得

一、要求原代细胞二倍体细胞50代以内异倍体细胞无限传代第二十二页，共七十五页。二、获得1、原代细胞细胞原代培养过程第二十三页，共七十五页。2、二倍体细胞系原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。特点：（1）二倍体；（2）有明显的贴壁和接触抑制特性；（3）有限的增殖能力；（4）无致瘤性。第二十四页，共七十五页。3、转化细胞系通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。自发的转化：在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞人为的转化：采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系第二十五页，共七十五页。优点：（1）无限传代；（2）倍增时间短；（3）对培养条件和生长因子的要求低；（4）适合于大规模工业化生产。第二十六页，共七十五页。4、融合细胞系细胞融合是指通过两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。（1）概念第二十七页，共七十五页。（2）动物细胞融合技术的发展简史：19世纪30年代——病理组织中发现多核细胞19世纪70年代——蛙血细胞多核细胞1958年——灭活的仙台病毒诱导人的腹水癌细胞融合成功后来——诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活第二十八页，共七十五页。a.仙台病毒融合法（3）细胞融合的方法：第二十九页，共七十五页。b.聚乙二醇融合法主要用于单克隆抗体的杂交瘤细胞技术。第三十页，共七十五页。c.电融合法利用细胞在短时间的强电场作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，而使相邻的细胞膜相互发生继发性融合.操作简便无化学毒性对细胞损伤小融合同步，融合率高可在显微镜下直接观察优点：5、重组工程细胞系采用基因工程方法构建工程细胞第三十一页，共七十五页。三、常用生产用动物细胞的特性BHK21：从地鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，用于构建工程菌，可生产疫苗。举例：CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞）：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于构建工程菌。第三十二页，共七十五页。MRC-5(人胎肺成纤维细胞)：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命42-46代，用于制备疫苗。WI38：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，倍增时间为24小时，有限寿命50代，用于制备疫苗。第三十三页，共七十五页。四、细胞库的建立用于生产的工程细胞建立：生产所需的细胞生产用细胞库（MWCB）原始细胞库（MCB）第三十四页，共七十五页。第四节动物细胞的培养条件和培养基

1、所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染；2、必须有足够的营养保证，绝对不可有有害的物质，避免有害离子；3、保证有适量的氧气供应；4、需随时清除细胞代谢中的有害产物；5、有良好的适于生存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度；6、及时分种，保持合适的细胞密度。动物细胞在体外培养所需基本条件第三十五页，共七十五页。玻璃器皿：培养瓶、滴管等浸泡（自来水或稀酸）、刷洗（洗衣粉）、冲水、烘干、酸泡（12小时）、流水冲洗、蒸溜水冲洗、三蒸水冲洗，50℃烘干塑料器皿：培养板、培养瓶、培养皿等。自来水冲洗、洗衣粉超声波清洗、冲水、晾干、酸泡（12小时）、流水冲洗、蒸溜水冲洗、双蒸水冲洗，晾干一、动物细胞的培养条件1.器材的清洗和消毒（1）器材的清洗第三十六页，共七十五页。（2）器材的消毒灭菌干热消毒

电热干燥箱:160℃，60-120min,用于玻璃器皿的消毒第三十七页，共七十五页。b.湿热消毒

高压蒸汽灭菌器:

用于布类、金属器材、玻璃器皿、液体、橡胶物品的消毒。第三十八页，共七十五页。c.紫外线消毒

紫外灯：主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒缺点:产生臭氧，影响身体健康。d.过滤除菌消毒

滤器：用于大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

第三十九页，共七十五页。滤器正压不锈钢过滤装置示意图

第四十页，共七十五页。e.消毒剂和抗生素

消毒剂：75%酒精、过氧乙酸、新洁尔灭用于操作人员的皮肤、实验台、器械、器皿的操作表面、实验室的椅、桌、墙、地面等的消毒。

抗生素：青霉素、链霉素等用于预防培养用液的染菌第四十一页，共七十五页。

超净工作台的工作原理：利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

超净台超净工作台：为细胞操作提供无菌环境第四十二页，共七十五页。自动双重纯水蒸馏器纯水仪水质的好坏直接影响细胞培养的成功与否有毒元素、金属离子、微生物污染。2.水质第四十三页，共七十五页。pH7.2~7.4，最适pH<6.8或>7.6，不利于细胞的生长3.pHpH的高低对细胞各种酶的活性，细胞的通透性、及许多蛋白的功能有重要影响。水质的好坏直接影响细胞培养的成功与否pH缓冲系统：如Na2HPO4/NaH2PO4缓冲系统pH缓冲剂：HEPES第四十四页，共七十五页。4.渗透压使用平衡盐溶液（BSS）保持细胞内外渗透压的平衡。成分主要为：无机盐和葡萄糖，如Hanks平衡盐。5.温度动物细胞最佳培养温度：37℃昆虫细胞最佳培养温度：27℃第四十五页，共七十五页。6.空气

氧气：采用培养瓶等培养，不需专门通气

采用生物反应器大量培养生产，要专门通气

CO2：细胞生长需要，又是细胞代谢的产物。与维持培养基的pH有关。第四十六页，共七十五页。CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2

使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：

①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒。③箱内蒸馏水槽中加入灭菌蒸馏水3000ml以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。CO2培养箱第四十七页，共七十五页。二、动物细胞培养基的种类和组成1.天然培养基生物性液体（如血清）组织浸液（如胚胎浸液）凝固剂（如血浆）2.合成培养基BME,MEM,DMEM,HAMF12,RPMI1640等产品第四十八页，共七十五页。合成培养基的成分（1）氨基酸细胞合成蛋白质的原料至少含12种必需氨基酸+谷氨酰胺（2）维生素维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅酶如维生素A、维生素D、维生素B2等。（3）糖类

碳源，如葡萄糖。第四十九页，共七十五页。（4）无机盐

保持细胞的渗透压并，缓冲pH的变化，并参与代谢。如NaCl,KCl,MgSO4,Na2HPO4等。（5）其他成分

核酸前体，如腺苷、鸟苷等。氧化还原剂，如谷胱甘肽等。动物血清，如小牛血清、胎牛血清。第五十页，共七十五页。添加小牛血清的作用：1、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；

如，胰岛素、表皮生长因子等；皮质醇、雌二醇等。2、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；如，纤维结合蛋白、胶原等。3、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；如，白蛋白等。4、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。如，胆固醇、前列腺素E等。铜、锌、硒等。第五十一页，共七十五页。3.无血清培养基提高了细胞培养的可重复性，避免了血清差异所带来的细胞差异；减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足、稳定；细胞产品易于纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；*减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于结果分析。优点：合成培养基+

激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素第五十二页，共七十五页。第五节动物细胞培养的基本方法一、细胞分离离心分离法从含有细胞的体液中分离细胞。如血液、羊水、腹水等。800~1000r/min,5~10min2.消化分离法生物体——组织块——剪碎——消化——终止消化——200目滤网过滤——单细胞悬液第五十三页，共七十五页。常用的几种消化液：（1）1%胰蛋白酶溶液（2）0.02%EDTA溶液（3）胰酶-柠檬酸盐（4）胰酶-EDTA溶液第五十四页，共七十五页。二、细胞计数1.自动细胞计数器计数：Coulter计数仪2.血球计数板计数：区分死活细胞：台盼蓝染色、苯胺黑染色计算：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×1×104

×稀释倍数公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而1ml＝1000mm3第五十五页，共七十五页。3.结晶紫染色细胞核计数法：细胞分散解离、破碎，细胞核蓝色。血球计数板计数。4.MTT染色计数法：细胞存活率检测四甲基偶唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。

MTT比色法的原理：活细胞中琥珀酸脱氢酶能将MTT还原成不溶干水的紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的紫色结晶量成正比。再用酶标仪测定OD值。

第五十六页，共七十五页。

操作步骤:（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入MTT液继续培养3-4小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长490nm）。培养板孔板振荡器酶标仪第五十七页，共七十五页。根据细胞生长的恃点，传代方法有3种1.悬浮生长细胞传代加入培养液，分瓶培养。2.半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。三、细胞传代第五十八页，共七十五页。贴壁生长细胞传代方法：吸光培养瓶中的培养液加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。吸去胰蛋白酶液，加入培养液。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内，1传2或1传3。加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。将后者放入培养箱中培养。第五十九页，共七十五页。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。四、细胞冻存和复苏第六十页，共七十五页。1、冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。第六十一页，共七十五页。（1）慢冻程序：程序降温盒：1℃/min降温4℃-20℃-80℃液氮（2）低温保护剂的应用：2、细胞的冻存在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。第六十二页，共七十五页。（3）细胞冻存方法预先配制冻存液：含血清培养基，10%DMSO。取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液。加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。第六十三页，共七十五页。从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，摇动使其融化（1分钟左右）。用培养液稀释至原体积的10倍以上。低速离心5分钟。去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。隔天观察细胞生长情况，并换液。3、细胞的复苏第六十四页，共七十五页。第六节动物细胞大量培养的方法

和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。1、悬浮培养优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：由于细胞体积小，较难采用灌流培养。*第六十五页，共七十五页。2、贴壁培养优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。第六十六页，共七十五页。3、贴壁-悬浮培养（1）微载体培养将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。优点：1、可创造相当大的贴附面积，2、载体体积较小，比重较轻，轻度搅拌即可携带细胞悬浮于培养基内，发挥悬浮培养的特长。第六十七页，共七十五页。微载体的条件１.表面性质与细胞有良好的相容性２.微载体的材料无毒性３.微载体的材料是惰性的４.微载体的比重在1.030～1.045g/ml５.粒径在60～250μm之间，且均一６.具良好的光学透明性