免疫荧光染色方法

免疫荧光染色方法（一）制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱；②除去防碍抗原一抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物于获得好的染色结果；③固定的标本于保存，如组织切片固定后在-2℃0下可保存一年而不改变其染色特性。标本的固定原则是：①能损伤细胞内的抗原：②能凝集蛋白质；③能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。常用抗原物质的固定方法抗原物质固也剂固定条件（）蛋白质抗原〜乙醇室温〜/、激素丙酮℃0免疫球蛋白四氯化碳病毒丙酮、四氯化碳、无水乙醇室温〜或℃〜多、细菌等微火加热，甲醇、甲醛、丙酮室温〜或℃~类脂（异嗜性抗原）甲醛，佛茂尔（M室温〜（三）水洗固定后以的液浸泡冲洗,最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。（四）染色染色分直接染色法与间接染色法。材料与试剂（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。（）液（）份优质甘油加份液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。（4）带盖方盘2．直接染色法（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做3〜。（）PBS冲洗3次，每次冲洗3，即3x3/冲洗。（3）蒸馏水冲洗。（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。间接染色法（）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育3；②以PBS液3x3/冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育3；④PBS3x3/冲洗；⑤冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。（）检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，日醇固定②滴加相应抗原液（按：〜：解释），37℃孵育3；③PBS液3x3/冲洗；@加荧光抗体，37℃孵育3；⑤PBS液3x3/冲洗；⑥水洗,凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。（五）结果显示荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。荧光强度的表示方法如下：＋＋＋〜＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。＋＋：荧光明亮，呈黄绿色。＋：荧光较弱，但清楚可见。±：极弱的可疑荧光。－：无荧光。（六）标本保存由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（）或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。荧光原位杂交（S实验步骤仪器设备医用微波炉；水浴锅；荧光显微镜；数字显^微照相机。S试剂(1)1xPBS：d10xPBS溶液稀释而成，储存于4℃；⑵20xSSC()；0()2xSSC，d20*99窘溶液稀释而成；2m蛋1白酶消化液。()变性液%甲酰胺+2xSSC，.0ml20xSSC；加1蒸馏水；2ml甲酰胺。每次新鲜配制。()杂交后洗涤液：20xSSC4川1；蒸馏水1ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节前升至室温。实验步骤1、脱蜡：1)二甲苯脱蜡次，每次m；2)100%酒精两次，每次2mn3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。2、蛋白酶处理:1)每个染色W缸40ml蛋白酶消化溶液，配制方法如下：2xSSC40ml倒人管l在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。2)℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶溶液。7孵育20min。)xSSC在室温下漂洗切片次，每次1m。）梯4度酒精脱水（-2℃0预冷）。、变3性：）每一个式染色缸配制0变性溶液；）782℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；）7℃孵育；）即移入2℃预70酒的染色缸内2，再依次移入0%0和100的2℃预沟内，每缸2；）空5气干燥。、杂4交：）准1备探针；）取2一个较大的湿盒，交叉放置切片；）滴出0〃1探针在片的组织上，加盖玻片；）盖4湿盒盖，37℃孵育12〜16。杂交后的水洗：）镊子5小心去除盖玻片；）℃预热杂交后水洗溶液0水洗片1i）2xSSC（37℃洗两次，每次10；）8放人染色W缸的IxPBS内待检测，方使片干燥。检测：）从9PBS中取出片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。）闻02片使用30〃l〜60〃l罗明抗地高辛抗体或TOC\o"1-5"\h\zI卵白素，室温下孵育20；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含IxPBS的染色京缸。IxPBS室温下洗3次，每次2。扩增：12）从IxPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30〃l〜60〃l抗卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20；1）去掉塑料盖膜，把切片放人含IxPBSm*JWL01xPBS室温下洗3次，每次2；1）从IxPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴30〃l〜60〃l抗卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20；1）1xPBS室温下洗3次，每次2。5、细胞核染色：1）张切片加10〃l〜20〃lDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2〜；12）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在2℃冰箱。切片在染色之后1内可以在显微镜下又观察。PI步骤1、常规脱帽浸入001lLPBS2、用02盐酸处理、蛋白酶K（25〃g/m1»yc℃15mi；4、分别用8％0，9％5和100％酒精脱水，室温干片；5＞加PC混合液25〃L（10mmol/LTris,l50mmol/LKCl，1.5mmol/L且d2,各加200〃mol/LdATP，dCTP，dT,1.5mmol/LdigIldUTP1.5〃1，引物250,T聚合酶2^，加盖；、℃变性5mi后置入℃湿盒中51^；、用0.1xSSC液，℃洗5mi；、片于℃10s〜20$；用4xSSC0.%吐温20液42℃洗5mi，2次；、经液1洗后滴加20%羊血清封闭0min10、加地高辛抗体复合物（1500室温下2；11、f液洗5mi；12、用CP显色门〜2，在镜下控制，终止显色；13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。5荧光原位杂交实验（原位杂交）.实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。.实验原理荧光原位杂交（S是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。的基本原是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，如卫星、卫星类的探针，其杂交靶位常大于,不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标■记的方法。间接标记是采用生物系标记的）经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进放大，从而可以检测b片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。.实验用具及材料染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色制、载玻片、、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、移液器、移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温2。0实验方法及步骤1）探针及标本的变性（1）探针变性将探针在5怛温水浴中温育，即置℃，〜1i使双链，探针变性。（2）标本变性①将制备好的染色体玻片标本于℃培养箱中烤片2〜。（经染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。②取出玻片标本，将其浸在〜5的体积分数甲酰胺/2xSSC的变性液中变性2-。③即按顺序将标本经体积分数、体积分数和％体积分数1冰乙醇系脱水，每次，然后空气干燥。2）杂交将已变性或预退火的探针1滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18*18盖玻片，用封片，置于源潮湿暗盒中℃要交过夜（约1〜1）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。3）洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。（1）杂交次日，将标本从3℃7温箱中取出，用刀片轻轻将盖

玻片揭掉。（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热为0的体积分数甲酰胺/2xSSC中洗涤次，每次。（）在已预热乎℃的1xSSC中洗涤次，每次。（）在室温下，将玻片标本2xSSC中轻洗一下。4）杂交信号的放大封闭液，用保鲜膜覆盖，℃于标本上C用保鲜封闭液，用保鲜膜覆盖，℃于标本上C用保鲜TOC\o"1-5"\h\z温育2。（2）去掉保鲜膜，再加15膜覆盖，37℃继续温育40b0的洗脱液中洗涤封闭液，覆盖保鲜膜，于标本上，覆盖新的为b0的洗脱液中洗涤封闭液，覆盖保鲜膜，于标本上，覆盖新的为0的新洗脱液中，洗次，每次i（4）在玻片标本的杂交部位加17温育2i（）去掉保鲜膜，加1保鲜膜，7温育。（6）取出标本，将其放入已预热涤次，每次i（）重复步骞（1）、（2）、（），再于2xSSC中室温清洗一下。（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取（9）取200i液a加在玻片标本上，盖上盖玻片。5）封片可采用同类型的封片液。如果封片中含有（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在2卜-7℃0的冰箱中的暗盒中保持数月之久。）荧光显微镜观察龄果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，的激发波长为0。细胞被染成红色，而经标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是染色体上的特异序，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。附录相关S溶液的配制附录相关S溶液的配制)20xSSC:C2柠檬酸钠，加水至000（用)0。2）去离子甲酰胺（D）:将10混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌0m，用man纸过滤。）体积分数0%酰胺/2xSSC：5mL甲酰胺，5mL20xSSC，10mL水。）体积分数50%甲酰胺/2xSSC：100mL甲酰胺，20mL20xSSC，0mLK。5）体积分数50%硫酸葡聚糖（口9）：℃水浴中融化，℃或2℃保存。）杂交液：ml体积分数25%口9，20mL20xSSC混合。（或0mL体积分数50%口9，20mL20xSSC，0mL混2合）取上述混合液50mL与5mLD混合即成其终浓度为体积分数10%DS2xSSC，体积分数50%DF。）/溶液原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100m加,取出1mL，加1双蒸水，使终浓度为25m/mL

原液以e缓冲液配制该溶液，使其浓度为10m原液以e缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mm，L用0mm的LC调值为甘油，混匀。。取上述溶液1mL，加mL溶液：与原液按体积比1：比例充分混匀，-2℃0保存备用。溶液：用去离子水配制1mLm储存液，按体积比1:300按体积比1:300以,溶液稀释成工作液。）封闭液：体积分数S，）封闭液：体积分数S，2mLSSC1mL，2O1mL20混合山10）封闭液：体积分数Sm,20xSSC1mL，250mL2250mL20mL混合。20mL11）荧光检测试剂稀释液：体积分数S，1mLxSSC1mL，2mL混合20mL020mL。12）洗脱液：1001^20xSSC，020mL。缓冲液：TOC\o"1-5"\h\z）溶液：。）溶液：,。）溶液：HrAC。）培养基：胰化蛋白胨，酵母提取物公水至，用调值至。附录探针团制备质克的提取、纯化和鉴定。）用接种环挑取一小块-7℃0冻存的转化菌，接种于养基中，3℃7剧烈震荡过夜。）将收集到的菌液离心,弃掉上清液。）将收集到的菌液离心,弃掉上清液。3）向菌体沉淀中加入溶液3）向菌体沉淀中加入溶液置于冰浴中片刻，再加溶液溶液，混匀后将其混匀，加酚和氯仿混合液（体积比为：）旨九分混匀。）离心。）取上清液，向其加入异丙醇，充分混匀后以离心〜，弃掉上清液。）用体积分数乙醇洗涤沉淀〜次，晾干。）用缓冲液溶解沉淀。）加水至，以（终浓）在℃水浴消消化。）加入酚、氯仿和异丙醇（三者体积比：：）溶液混匀，离心。1）0取上清液，再加入氯仿和异戊醇溶液（体积比为2：41）200混匀，离心。）取上清液，以M体积分数乙醇沉淀。TOC\o"1-5"\h\z）可将上述溶液在℃放置至以充分沉淀，然后用离心。）将沉淀用体积分数0醇轻洗，自然晾干。）用缓冲液溶解。）取〜上述纯化的溶液，于琼脂缓冲液凝胶电泳鉴定并检J测浓。）取，用相应限制性内酶〜单位，〜，于7水浴