诊断遗传变异提高药物疗效

1如有帮助欢迎下载支持诊断遗传变异提高药物疗效过去三十年期间的研究表明，病原体的遗传变异与人的遗传变异一样已经形成药物疗效产生个体差异的基础，如临床上出现的抗菌与抗病毒药物的耐药表现，以及人类细胞色素P450药物代谢酶基因和编码药物结合酶[如N-乙酰转移酶(NAT2)、硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)和谷胱甘肽转移酶(GST)]等多种基因的遗传■遗传变异的多样性最初的人基因多态性研究表明，少数共同的变异以及绝大部分的不同酶活性与药物疗效有关。但是，最近的研究提示，药物疗效的可变性与复杂疾病的基础遗传学一起可能涉及许多不同的基因和变异，这些基因变异改变了蛋白质的表达或功能。遗传变异的数量和种类对药物疗效的影响已反映在整个人类基因组研究当中，如研究单核苷酸多态性(SNPs)、插入或敲除、基因转化、完全的基因敲除、基因复制和扩增等各种已知的变异类型。此外，个别基因或基因簇正日益被看作药物疗效的生物标志物。这种基因组学变异的多样性对开发常规的试管内诊断化验不同类型变化的探测，而其他的则相当有限，往往需要进行补充化验才能提供完整的基因型。■分子标记物与检测方法联动发展基于聚合酶链反应(PCR)的化验与各种后PCR检测方法结合后就构成了大多数分子诊断化验的基石，用于核酸分析，也用于药物基因组学开发。每一新发现都为药物疗效的判断增加了复杂性，从而需要不断发展出可预期检测的生物分子SNPs情形中，或确定少数基因的不同基因表达时，可以应用实时均相PCR检测化验，以及其他一些复针融合分析、Invader探针、单碱基延伸(SBE，或微型顺序分析)与寡核苷酸连些不同的标记检测方法(如荧光、化学发光或者电气化学)以及仪器平台也可以合或微阵列通用Tag阵列、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪等各种方法进行检测分析。当标记物的复杂性使得上述技术难以进行多样反应分析时，在单次化验中进行多种标记物的检测就需要采用不同形式的阵列技术。应用这些基于等位基因特ineBlots步基因分型。例如，十年前的固定式寡核苷酸探针“线性阵列”是用于开发人类白细胞抗原(HLA)－A位点多态性分型的方法，这一方法也用于开发编码其他HLAs基因、囊性纤维化跨膜转运调节物(CFTR)蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)耐药以及人D的寡核苷酸微阵列技术来简2如有帮助欢迎下载支持PCR度寡核苷酸微阵列技术是惟一能同步检测在删除与基因复制事件的方法，对CYP2D6基因的寡核苷酸微阵列基因分型就是一个例子。迄今为止，这是惟一能同步进行遗传变量的不同基因分型的检测方法。■关注基因的差异表达最近，研究人员已将注意力转向mRNA转录产物的全面分析，以鉴定出差异表达的基因，这些基因在人类疾病生物学与药物疗效中发挥重要作用。现在，微阵列技术的应用与成熟的数据分析工具设计已用于评价所有或大多数的已知人类基因，从而比较正常组织与病变组织之间不同的基因表达方式，揭示易于区别前者与后者的模式或“信号”。例如，基因表达模式可以显示特异基因由于遗传变异、转录调节变化或后天影响而在特异的癌症标本中的“过表达”。在某些情形中，过表达或表达不足的蛋白都可以作为药物靶标或药物疗效的调节物。因此，基因表达信号可作为预期对特殊的药物治疗可能产生反应的分子标记癌症的巨大异质性使得高密度微阵列平台尤其适合用于发现癌症潜在的诊断与预兆标记物；而蛋白质组分析技术，包括二维凝胶分析、MALDI-TOF质谱仪与蛋白质阵列，正在提供补充信息，可能产生能指导癌症治疗决策的新诊断方法。将遗传学、基因组学与蛋白质组学技术用于开发分子诊断学，能为改进治疗选择和提高药物疗效提供许多机会。这种诊断学研究带来了许多挑战，包括生物学与技术复杂程度的挑战，以及与多种分析物有关的新调整问题，如复杂的应用仪器与化验方式以及用于解释检测结果的运算法则与软件等。传统方法的局限除了CYP2D6之外，其余均属于低复杂性的化验类型。P化，为每一变异产生一个限制位点。这些诊断分析方法目前仍局限在研究中使用，因为其操作很繁琐，而且工作强度大，难以用于常规临床诊断学的自动化或大批量使用。此外，这一方法还可能因不完全限制消化而产生错误的结果；这种方法需要开放后PCR的反应管，采用限制酶进行扩增处理，这样就需要制备物理分离样本染所产生的假阳性。杂交探针渐入临床被设计用于每一个基因多态性位点：利用荧光共振能量转移(FRET)原理的优势，一种终端用供体染料标记，另一终端用受体染料标记。对这些探针最适宜的杂交PCR于标记物的定量测定，3如有帮助欢迎下载支持错配探针的融合温度比完美匹配低一些，从而容易区别是否存在两种等位基因的这种方法也允许单一发光子报告染料与一对以上可被其杂交/变性最佳温度区分的杂交探针一起使用。目前，研究人员已经开发了许多药物基因组化验方法当前开发出来的一些具有同质荧光检测能力的Thermocylers以及具有增强酶反应速率的耐热DNA聚合酶，已经降低了PCR反应与分析所需时间。运用这些新的能为未来某一刻基于PCR的临床常规化验提供基础，但仍然面临各种标本(包括血液、口腔细胞、组织标本)的制备能否快速自动化的挑战，所以还难以进入临用于区别简单顺序变异的现代技术多采用等位基因特异杂交原理。等位基因质实时检测或动力PCR检测而被检出。在应用安全与自动操作方面，同质实时检测是对电泳分析方法的明显改进。一反应试管中扩增子载体上的染料所产生的荧光信号能指示预期的扩增产物，而不被引物中的二聚物等所干扰。因为基因多态性的直接检测更适用于临床诊断，因而基因分型化验就必须经常性进行，否则，还得检测两个或更多的多态性才能明确其结果。目前技术上已这种需求。现在，同质扩增与直接探针变量检测逐渐在单一和多元基因分型中推这些双标记探针可报告发光子经自然寡核苷酸探针结构中的受体染料的熄灭过程，TaqMan可以被实时定量测定，荧光亮度随后来的每个扩增周期而增强。可测定的信号越过阈值(指定为CT)的周期长短的一种，还是存在杂合状态。确定CT截止点与开发检测运算法则，能可靠地“识别”每一个多态位点。应当注aqMan技术的试管诊断自动控制技术。高密度微阵列的应用高密度寡核苷酸微阵列为基于磁珠的检测方式提供了新的选择，并且具有更厘米的玻璃Affymetrix微阵列可以容纳一百万以上独特的寡核苷酸顺序，每一序列的空间定位于11平方微4如有帮助欢迎下载支持米位置内。这种类型的阵列与灵敏的扩增方案相结合，能够对人类基因组范围内SNPs些工具目前正用于大规模的、基因组范围的联合研究，以发现人类疾病的遗传生物学标记。此外，运用完整的晶圆阵列与数千万的寡核苷酸探针平铺于整个染色体区域的方式，目前正运用于常见遗传变异的基因组SNP发现当中。高密度的寡核苷酸探针正用于一些基于基因表达的诊断方法的开发之中，对没有诊断的基因分型也多是运用这一程度的探针密度。高密度特征的研发使得阵列的体积相对较小，成本较低，同时还可提高多态性检测的精确度。为了采用高密度寡核苷酸微阵列进行基因分型，基因中的重要区域首先应被下杂交。其杂交产物Amplicons采用抗生物素－藻红蛋白共轭物染色，与特异探针特征性结合的荧光可被激光照明的共焦扫描仪检测到。基于寡核苷酸阵列的化验往往运用一套完美匹配与一套错配寡核苷酸之间的比较荧光信号来检测多态性，同时减少交叉杂交的影响。通过应用已知基因型的测试标本进行软件与运算法则以鉴定标本中存在的多态性、等位基因与基因型。这种方法已经用于RocheCYPC以同时进行分析。最近，AmpliChipCYP地区人群中包括础。微阵列分析与基因差异表达同时，基因表达谱已经开始为慢性致命性疾病的药物治疗效应提供预测信息，并指导治疗选择，而寡核苷酸微阵列平台具有应用于药物基因组学研究的潜在优势。■微阵列分析的特点DNA析的分析物是信使RNAsRNARNAsDNA或在大多数的微阵列分析中，或在产生cRNA拷贝的试管内转录(IVT)线性扩增寡核苷酸阵列时往往被分裂。在研究中，基因表达阵列常常采用被标记的cRNAs或长寡核苷酸作为固定探针，以及由类似于半导体工业应用的光刻技术制造的寡核苷酸探针阵列；寡核苷酸探针可直接在微阵列表面合成，还可以应用多空间的完美匹配单碱基－错匹配探针对来查询每一个重要的基因。这种高密度寡核苷酸探针诊断方法可检测出拼接变异种的能力，以及因特殊转录而造成融合基因时产生的特异性嵌合转录(如慢性髓细胞白血病中的BCR－ABL)。目前有很多种途径来对成千上万的探针强度数据点进行数据分析，最近提出的是临床应用表达类型的最佳实用指导方针。各种全自动化的分析方法(如层次聚类算法与运用自组织图)可供用于确定具有相似表达类型的分组基因之间的关系。同样，还有一些需操作人员监管的分析方法(如支持向量机)，可应用同质PCR可能有效的患者。■促进肿瘤诊治水平提高基因的表达差异是药物疗效的基础。基因表达的各种分析方法正在开发过程5如有帮助欢迎下载支持成人或儿童白血病的微阵列基因表达分析可以鉴定与特殊染色体易位或删除有关的分子图表类型，这样可以选择不同的治疗方案。此外，在药物开发期间常规地进行肿瘤组织的基因表达分析，有可能鉴定出能预测药物效应的表达类型。现在，科研人员通过分析在乳腺癌细胞株中5氟尿嘧啶(5-FU)诱导的基因表达，已经确定了与耐药和疗效有关的基因；取自针吸活检的mRNA的寡核苷酸微阵列分析获得的基因表达类型能预测乳腺癌患者服用多烯紫杉醇(Docetaxel)的疗效；对B系急性成淋巴细胞白血病患儿的白血病细胞所做的基因表达分析已经鉴定出来一套不同表达的基因，它们与对强的松、长春新碱、天冬酰胺酶制剂或柔红霉素的敏感性或耐药有关——这些信息在未来可用于指导治疗选择。采用寡核苷酸微阵列的基因组分析可以结合生物信息分析，以精选出对诊断测试开发具有高度预测价值的最精简的不同表达基因，以便可用于低复杂性的诊断化验之中。例如，在预期乳腺癌患者服用他莫西芬的疗效时，将雌激素受体阳基因表达比率，有助于开发简单的RT－PCR测试方法。gos分析一个高度同源的基因族的基因分型成员时，或存在假基因时，通常需要一个PCR步骤，以避免不利的交叉杂交。对于多态性检测来说，当先后杂交后靶标区域时，一个Invader寡核苷酸探针可通过一个碱基来交迭一个等位基因特异的检ET生采用标准的荧光能读取机读取的一个荧光信号。与FRET试盒，采用不同的荧光染料标记探针，能在单次反应中检测到两种等位基因的变异。的药物(包括精神病与心血管疾病的许多治疗药物)。为检测大量的多态性，CYPCYPD的多态性均