实验四血凝及血凝抑制实验

实验四血凝及血凝抑制实验第一页，共二十二页，2022年，8月28日实验目的1.了解血凝及血凝抑制实验原理2.掌握血凝及血凝抑制试验方法3.掌握基本操作技术,了解其实用价值第二页，共二十二页，2022年，8月28日实验原理凝集试验：颗粒性抗原与相应抗体结合后发生凝集的血清学试验。抗原与抗体复合物在电解质作用下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块。试验可在玻板上进行，称为玻板凝集试验，可用已知抗原检查未知抗体，或用于已知抗体诊断未知抗原，；亦可在试管中进行，称试管凝集试验，主要用于抗血清效价测定。第三页，共二十二页，2022年，8月28日实验原理某些病毒具有凝聚某些动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称为血球凝集试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但是病毒的血凝可为相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制实验，具有特异性，通过HA-HI实验，可用已知的血清来鉴定未知的病毒第四页，共二十二页，2022年，8月28日血凝试验原理血凝素（hemagglutininHA）：（HA，从H1—H15),呈柱状由病毒基因编码的糖蛋白刺突。功能：①吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒侵入细胞②凝集多种动物的红细胞（血凝试验）：HA能与人或其它动物多种红细胞表面N－乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集③具抗原性：其抗体能中和病毒---中和抗体：抑制血凝（血凝抑制试验）血凝素（HA）柱状流感病毒结构模式图第五页，共二十二页，2022年，8月28日血凝原理血凝抑制原理第六页，共二十二页，2022年，8月28日血凝抑制试验原理

病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸附于红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝集的现象，称为血凝抑制．

第七页，共二十二页，2022年，8月28日实验材料器材：U型或V型微量反应板、微量移液器、枪头试剂：1%鸡红细胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生理盐水第八页，共二十二页，2022年，8月28日实验步骤1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul生理盐水2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。第九页，共二十二页，2022年，8月28日第十页，共二十二页，2022年，8月28日3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡，室温静止感作15-30min，每5min观察一次结果。5.计算血凝效价，稀释使成为四价备用．以出现十十血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，即为1个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为1∶320，为1个单位，4个单位即为1∶80稀释。下面前经校对取4个血凝单位用于实验第十一页，共二十二页，2022年，8月28日血凝试验结果判定效价判定：凝集特别显著：“＋＋＋＋”凝集现象次之：“＋＋＋”凝集清楚可见：“＋＋”稍显凝集者：“＋”血凝效价：呈“＋＋”凝集时的最高稀释度。此时的稀释度即为1个血凝单位。第十二页，共二十二页，2022年，8月28日结果判定1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定

血凝反应强度示意图“4＋”红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱缩。“3＋”红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。“2＋”红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。“＋”红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。“－”红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价。第十三页，共二十二页，2022年，8月28日血凝抑制1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul生理盐水。2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。第十四页，共二十二页，2022年，8月28日第十五页，共二十二页，2022年，8月28日3.在1-12孔内均加入“四价”血凝素25ul，震荡后，室温静止作用5min。4.在1-12孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震荡，室温感作15-30min，每5min观察一次结果。5.观测结果，记录实验数据．第十六页，共二十二页，2022年，8月28日血凝抑制试验结果判定测定孔RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)

凝集（-）病毒对照孔：凝集RBC对照孔：无自凝血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制的最高血清稀释度。

第十七页，共二十二页，2022年，8月28日第十八页，共二十二页，2022年，8月28日第十九页，共二十二页，2022年，8月28日思考问题1.计算出病毒的凝集价、血凝抑制价2.血凝试验中为什么要加补充液？3.为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？4.病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反应?血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应?为什么?第二十页，共二十二页，2022年，8月28日孔号1234567891011(+)12（-)HA稀释度248163264128256、、、、弃生理盐25252525252525252525x25血凝素2525252525252525252525血凝素x生理盐水2525252525252525252525251%鸡红细胞252525252525252525252525结果预测++++++++++++++++++++++++++--++++_孔号1234567891011(+)12（-)HI稀释度248163264128256、、、、弃生理盐25252525252525252525X25待检血清2525252525252525252525x4HA血凝素2525252525252525252525251%鸡红细胞252525252525252525252525结果预测-----++++++++++++++++++-+