植物细胞悬浮培养

植物细胞悬浮培养第一页，共五十四页，2022年，8月28日强心苷类（侧链为不饱和内酯环）甾醇第二页，共五十四页，2022年，8月28日（3）生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。（4）醌类：包括蒽醌、萘醌等。（5）蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂。植物病毒抑制剂、植物抗生素等。（6）黄酮类：具有C6-C3-C6结构，生物合成前体是苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。多为治理心血管疾病和高血压的药物成分。小檗碱蒽醌黄酮第三页，共五十四页，2022年，8月28日植物细胞培养制药进展第一个专利：1956年Routin和Nickell首次数提出利用植物细胞培养技术生产天然产物的第一个专利工业植物生物技术：20世纪90年代明确提出已经从200余种药用植物获得了愈伤组织或细胞悬浮培养物（傅经国等，2004）国际日本：紫草人参红豆杉欧美：美国－红豆杉；德国－紫锥菊国内：罗士韦叶和春郑光植侯嵩生丁家宜第四页，共五十四页，2022年，8月28日利用途径生产次生代谢产物的优点不受季节、环境、病虫害影响.不占耕地，适用于贫瘠的地方代谢产物生产可以在可控条件下进行,可以通过细胞株筛选、特定生物转化途径与代谢调控提高目标产物含量.第五页，共五十四页，2022年，8月28日技术路线

目标植物选择→愈伤组织诱导→→液体培养→→培养条件的优化→→反应器扩大培养→愈伤组织诱导→→固体、液体培养→→高产细胞系筛选→→生物合成途径的研究→器官分化（发状根）→→固体液体培养条件的优化→→反应器扩大培养→→有效成分提取、分离第六页，共五十四页，2022年，8月28日植物细胞培养是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术。第七页，共五十四页，2022年，8月28日植物细胞培养的特点:⑴大小;⑵细胞团的形式存在;⑶纤维素细胞壁和大液泡,易被剪切力损伤;⑷生长缓慢⑸培养基成分丰富而复杂,易被微生物污染;⑹需光、氧、二氧化碳第八页，共五十四页，2022年，8月28日培养类型按培养对象来说，可分为原生质体培养和单细胞培养；按培养基类型可分为固体培养和液体培养；按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养。第九页，共五十四页，2022年，8月28日植物单细胞分离和初步培养单细胞获得：机械法；酶解法；愈伤组织法单细胞培养：平板培养(platingculture)看护培养法（nursingculture)饲养层培养(feedinglayerculture)第十页，共五十四页，2022年，8月28日单细胞分离方法机械法具体做法：将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团优点：细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。第十一页，共五十四页，2022年，8月28日单细胞分离方法酶解法酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。酶解法的优点可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。第十二页，共五十四页，2022年，8月28日细胞平板培养（platingculture)指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×103个/毫升植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。第十三页，共五十四页，2022年，8月28日细胞平板培养（platingculture)平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数植板率＝每个平板接种的细胞总数第十四页，共五十四页，2022年，8月28日细胞平板培养（platingculture)优点： ①单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。 ②由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。第十五页，共五十四页，2022年，8月28日细胞悬浮过滤与培养基混合植板培养克隆愈伤组织第十六页，共五十四页，2022年，8月28日看护培养（nurseculture）Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。第十七页，共五十四页，2022年，8月28日第十八页，共五十四页，2022年，8月28日微室培养(microchamberculture)在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。由Jones等在1960年设计的。优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。细胞起始密度：30～80个/室。第十九页，共五十四页，2022年，8月28日第二十页，共五十四页，2022年，8月28日双层滤纸植板培养Horsch等（1980）建立培养皿培养基饲养细胞层培养细胞看护滤纸转移滤纸第二十一页，共五十四页，2022年，8月28日固体培养固体培养是在培养基中加入一定量的凝固剂，经加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基。优缺点简便易行、所占空间小生长的不平衡，易出现极化现象易堆积生长过程中排出的有害物质有些生理生化指标测定不方便常用的固化剂琼脂、明胶（10%）等第二十二页，共五十四页，2022年，8月28日液体培养1．成批培养法batchculture细胞和培养基一次性加入到培养容器或生物反应器内进行培养,在培养过程中培养液体积不变,不添加营养成分,待细胞增长和产物积累到适当的时间,一次性收获细胞、产物和培养液的培养方法.第二十三页，共五十四页，2022年，8月28日液体培养1．成批培养法batchculture特点：操作简单，培养周期短.直接反映细胞生长代谢过程.可直接放大不能控制底物浓度、细胞易老化、生长周期短、效率低.两步成批培养法即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。第二十四页，共五十四页，2022年，8月28日2.半连续培养法semi-continuousculture重复分批式培养或换液培养.在细胞增长和产物形成过程中,每间隔一段时间从中取出部分培养液或细胞,剩余的细胞作为种子,再用新的培养液补足到原体积,使生物反应器内的总体积不变.特点:细胞可持续指数生长,并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平,培养过程中可延续很长时间.可进行多次收获.操作简便,生产效率高.第二十五页，共五十四页，2022年，8月28日3．连续培养法(continuousculture)连续培养法是在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基，同时含有细胞的培养液以相同的速度连续从生物反应器流出，以保持培养体积恒定的培养方式。该法的理论基础是根据Monod公式，即生长速度取决于基质的浓度。

µ＝µmax·S/(Ks+S) µ=特定生长速度；µmax=特定最大生长速度；Ks=饱和系数；S=基质浓度两阶段连续培养法于第一反应器中投入生长培养基并连续加入该培养基，而于第二反应器中投入生产培养基。

第二十六页，共五十四页，2022年，8月28日3．连续培养法(continuousculture)特点:细胞能在近似恒定状态下生长、营养物质浓度、产物浓度、pH基本保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可基本维持不变，细胞维持持续指数增长。稳定状态可有效地延长分批培养中的对数生长期。第二十七页，共五十四页，2022年，8月28日3．连续培养法(continuousculture)问题:一直有细胞收获，浓度一般不高细胞分裂快、易变异；由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染对设备、仪器的控制技术要求较高。第二十八页，共五十四页，2022年，8月28日悬浮培养（Suspensionculture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。特点

1.培养细胞可不断增殖，且生长速度快。

2.液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相对保持一致。第二十九页，共五十四页，2022年，8月28日细胞悬浮培养的建立愈伤组织的诱导悬浮系的建立与继代培养悬浮细胞的生长动态悬浮细胞同步化第三十页，共五十四页，2022年，8月28日愈伤组织的诱导选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。选择适宜的培养基：较高激素浓度；必要的附加物质。第三十一页，共五十四页，2022年，8月28日要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎第三十二页，共五十四页，2022年，8月28日悬浮系的建立与培养callus150~250mlflaskcentrifugeisolationsubculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm第三十三页，共五十四页，2022年，8月28日第三十四页，共五十四页，2022年，8月28日成功的悬浮细胞培养体系特征悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天便可增加一倍。第三十五页，共五十四页，2022年，8月28日第三十六页，共五十四页，2022年，8月28日第三十七页，共五十四页，2022年，8月28日悬浮细胞的生长动态第三十八页，共五十四页，2022年，8月28日悬浮细胞生长的衡量根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞质量变化。生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养时间(t)的比值

p＝(lnx-lnx0)/t鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生长情况干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量第三十九页，共五十四页，2022年，8月28日影响悬浮细胞生长的因素起始愈伤组织的质量接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般在0.5~2.5×105个细胞/毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。第四十页，共五十四页，2022年，8月28日影响悬浮细胞生长的因素培养基应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定培养基设计时,一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。常用的培养基有MS、B5、LS、N6等。植物激素和其他附加成分的应用。第四十一页，共五十四页，2022年，8月28日影响悬浮细胞生长的因素培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌式）；分批培养，半连续培养和连续培养温度25℃继代周期指具有一定起始密度的细胞,从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的长短、生长速率等决定。继代培养（Subculture）：继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。第四十二页，共五十四页，2022年，8月28日悬浮培养细胞的同步化细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化是十分困难的。同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、代谢以及生理生化状态等复杂化。通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。什么措施？第四十三页，共五十四页，2022年，8月28日细胞周期第四十四页，共五十四页，2022年，8月28日饥饿法饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化细胞。将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可重新恢复。第四十五页，共五十四页，2022年，8月28日抑制剂法通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷(FudR)和羟基尿(HU)。用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。第四十六页，共五十四页，2022年，8月28日分选法依据：细胞体积大小方法常规分选方法是梯度离心精细的分选可采用流式细胞仪优点操作简单分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理带来的副作用缺点分选精细度较差第四十七页，共五十四页，2022年，8月28日低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细胞较好地同步化。梅兴国等（2001）采用6℃低温处理红豆杉细胞也获得较明显同步化效果。可能的原因不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响，在一定范围内，温度下降使细