2023届新高考生物备考复习：生物高考试题中“双酶切”问题

2023届新高考生物备考复习

生物高考试题中〃双酶切〃问题

一、图解限制酶的选择原则

目的基因：编码蛋白质的基因或具有

调控作用的因子

启动子:RNA聚合酶识别和结合的部位;

能驱动基因转录出mRNA

终止子：转录的终点，在转录过程中起

调控作用

标记基因:供重组DNA分子的筛选

DICID”标记基因

^O£co

PstISma1Pst1\T

SmaI玩病EcoRISmaI

基因

甲乙

Q)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择为打，而不选择Sma工。

(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具

备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择

Smalo

(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，

如图甲中"st工；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不

同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst工和以工两种限

制酶。

二、利用PCR法获取和扩增目的基因

第一次循环第二次循环第三次循环

产生2个分子产生4个介子产生8个分子

PCR扩增目的基因过程示意图

从某个DNA中获取目的基因（目标序列这个DNA就相当于模板DNA

了，需要进行PCR扩增的是这个DNA上某个特定的基因。因此要设计好引

物，然后进行PCR,经过3个循环就能获得目的基因。

三、PCR犷增目的基因时添加限制酶的识别序列

如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为

使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别

引入哪两种限制酶的识别序列（A）

注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。

A.Ndel和BamH工B.Nde工和Xbal

C.Xba工和BamHID.EcoR工和Kpn工

目的基因的插入要有正确的方向才能正确表达，载体和目的基因的

酶切用的是两种不同的酶，就可以实现目的基因的定向插入。

例：若要利用某目的基因（见图甲）和Pi噬菌体载体（见图乙）构建重组

DNA（见图丙），限制性内切核酸酶的酶切位点分别是Sg/UWGATCT）、

必oRI（GiAATTC）和Sau3AI（（ATC）。下列分析合理的是（）

BglIT3AIBglII

EcoRIEcoRI

一表示RNA一一表示3个酶切重组DNA

聚合酶的移位点在载体上

动方向的排列顺序

甲乙丙

A.用Ec品I切割目的基因和Pi噬菌体载体

B.用Bglll和EcoRI切割目的基因和P,噬菌体载体

C.用Bgl\\和SagI切割目的基因和Pi噬菌体载体

D.用Ec（RI和Sau3AI切割目的基因和P,噬菌体载体

答案

D解析解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRI和

Sau3AI切割目的基因和Pi噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的

目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。

四、高考试题分析

（2021•山东，25）人类丫基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合

位点,该位点结合BCL11A蛋白后，丫基因的表达被抑制。通过改变该结合

位点的序列，解除对Y基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治

疗。科研人员扩增了Y基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达

载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相

关信息如图所示。

注：

F1-F7,R引物

P：雌激素诱导下发挥

----+----干作用的启动子

：F1F5如1nMm1:Ji终止子限制前畤U序列及切割位点:

戟体的终止子Muni:GLATTG

白基因BCLIIAS^

部分结构/Xhol：CTCGAG

□EcoRI：dkATTC

NhelEcoRIMun\&oRIA7x>I终止子Sall:虫CGAC

Nhel:CTTTAGC

Q）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端

添加限制酶识别序列。据图可知，在Fl~F7末端添加的序列所对应的限制

酶是__________在R末端添加的序列所对应的限制酶是____________本实

验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要_______种酶。

析：

荧光蛋白基因的左侧为终止子，为了能指导荧光蛋白基因表达，扩增

后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧，而右侧有三个酶切位点，分别

是Muni、EcoRI和Xhol的切割位点，但因为用EcoRI会破坏荧光蛋白基

因所以只能用Muni和Xhol切割载体切割后载体的部分序列如图所示：

荧光强白幕因II

/CAATTCCTC6AG

GTTAACGAGCTC

MunIIXho1

|川科用限制牌切削

英光册门号囚

/CAATTCCTCGAG

BHL___

GTTAAC_\CACCTC

此外皎更被砂换为犷增筋的产物

需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动

子的扩增后的产物读取方向（RNA聚合酶的移动方向）与荧光蛋白基因的读

取方向（RNA聚合酶的移动方向）一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋

白基因中限制酶例〃〃I识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入

并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制

酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。

观察最右侧给出的限制酶的识别序列和切割位点的特点发现：限制酶

Mun\识别并切割后的黏性末端与限制酶民乐I识别并切割后的黏性末端相

同，限制酶XhoI识别并切割后的黏性末端与限制酶SalI识别并切割后的

黏性末端相同。

启动子读取方向

调控序列

及启动子

Sall：F1F2--「一-F7I\：|

1XhoIMunIVSalI终止子

载体的部终止荧光蛋、拼接BCL11A

分结构子白基因IR基因

11I

NheIEcoRIMunIEcoRIXhoI终止子

.启动子读取方向

有同学会发现，怎么构建好的一个基因表达载体，怎么出现了2