S3401糕点糖果中大肠菌群的测定培训

M3-4糕点、糖果中大肠菌群的测定食品检验工（中级）大肠菌群的定义及范围1大肠菌群的生物学特性2测定意义3目录页CONTENTSPAGE大肠菌群的测定方法4一、大肠菌群的定义及范围大肠菌群：是指一群在36℃下，48h内能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。二、大肠菌群的生物学特性1、形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。二、大肠菌群的生物学特性2、发酵乳糖产酸产气EMB平板二、大肠菌群的生物学特性3、培养特性：在伊红美蓝琼脂（EMB）上典型菌落：呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。麦康凯琼脂平板三、测定意义1、大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。以大肠菌群作为粪便指标菌原因在粪便中数量最大；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；检测方法简便容易。2、表示对人体健康是否具有潜在的危险性3、反映了食品在生产、加工、运输、储存等过程中的卫生状况。食品中大肠菌群数是以每1mL(g)检样中大肠菌群最可能数（MPN）表示的。四、食品中大肠菌群的测定方法四、食品中大肠菌群的测定方法（一）第一法MPN计数法（二）第二法平板计数法（三）MPN法与平板计数法的特点与应用范围（一）第一法MPN计数法1、检验程序2、培养基原理3、操作步骤4、结果报告5、注意事项食品中大肠菌群的测定方法初发酵0将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤LST不产气（－）小导管里无气泡LST产气（+）验证1、检验程序食品中大肠菌群的测定方法2、培养基原理（1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤月桂基磺酸钠（十二烷基磺酸钠）：抑制革兰氏阳性菌的生长。乳糖：是大肠菌群可利用发酵的糖类。胰蛋白胨：提供基本的营养成分。食品中大肠菌群的测定方法空白管阴性管阳性管2、培养基原理（2）煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤牛胆粉：可抑制革兰氏阳性菌。煌绿：是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的抑制作用。乳糖：是大肠菌群可利用发酵的糖类。发酵试验判定原则：产气为阳性。培养基可由原来的绿色变为黄色，同时可看到管底通常有沉淀。食品中大肠菌群的测定方法空白管阴性管阳性管3、操作步骤食品中大肠菌群的测定方法3、操作步骤（1）样品处理与稀释全过程不得超过15min。样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间食品中大肠菌群的测定方法3、操作步骤（2）初发酵试验以48±2h为最终观察结果时限。结果也以此时为最终结果。食品中大肠菌群的测定方法3、操作步骤（3）复发酵用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中，置36℃±1℃温箱内，培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。食品中大肠菌群的测定方法4、结果报告0.10ml0.001ml0.10ml0.01ml0.01ml0.001ml食品中大肠菌群的测定方法4、结果报告根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表MPN：最可能数，基于泊松分布的一种间接计数方法阳性管数MPN95%可信限0.100.010.001下限上限000<3.0-9.50013.00.159.61003.60.1718333>1100420-食品中大肠菌群的测定方法4、结果报告①这个MPN检索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北欧等标准通用的。②表里的数字是有小数点的。③报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单位是100g/ml。（如果产品标准的大肠菌群使用每100g(mL)单位，那么允许使用2003版本。）④原标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个组合。⑤当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时，如：阳性管数为122，123，232，233等时，建议增加稀释度(可做4~5个稀释度)，使样品的最高稀释度能达到获得阴性终点，然后再遵循相关的规则进行查找，最终确定MPN值。食品中大肠菌群的测定方法计算例次不同稀释度阳性管数MPN[/mL(g)]10－110－210－31000213033134231521060027303大肠菌群如果如下面几种情况，如何报告？食品中大肠菌群的测定方法5、注意事项（1）制备LST肉汤和BGLB肉汤时时，在小发酵管倒置于培养基的试管中时，若其中一段有空气，经加压灭菌后会自然消失。使用前必须经检查，凡有气泡者不能使用的。（2）第一步中即使发酵结果呈阳性（样品发酵的结果）的也不能说明大肠菌群为阳性。只有通过证实实验后为阳性结果的才能说明结果为阳性。（3）在LST初发酵过程中，若发酵套管内只有极微小气泡，也应视为产气阳性，把两个步骤结合起来检验。而对未产气的发酵管有疑问时，可用手轻打试管，如有气泡沿管壁上浮，也视为阳性作进一步实验，该情况的阳性要检出率为50%以上。食品中大肠菌群的测定方法5、注意事项（4）MPN表只给了3个稀释倍数，即0.1、0.01、0.001g（mL）若改用1、0.1、0.01mL（g）或0.01、0.001、0.0001mL（g），则表内的数字应相应降低或增高10倍，其余可类推。（5）在MPN表中，3个稀释倍数的检测结果都是阴性时，应该按<3.0封定，这样更能反映实际情况。（6）在MPN表中列出的g（mL）系指原样品（包括液体和固体）的体积（质量），并非样品稀释后的数值，对固体样品更应注意。如lg固体样品经10倍稀释后，加入1ml量，则实际只含有0.1ml样品，故应按0.1ml计，而不应按1ml计。食品中大肠菌群的测定方法（二）第二法平板计数法1、检验程序2、操作步骤3、培养基原理食品中大肠菌群的测定方法1、检验程序选择菌落数为15~150个的平板计数典型和可疑菌落计数36℃±1℃18h~24h挑选10个菌落接种到BGLB,37℃，24-48h典型菌落为紫红色周围有红色胆盐沉淀环，0.5mm食品中大肠菌群的测定方法2、操作步骤（1）样品稀释：同第一法。（2）平板计数：VRBA倾注平板→VRBA覆盖平板表层作用①防止菌落蔓延，形成菌落形态容易判断②产生胆盐沉淀环不会连成一片36±1℃培养18~24h食品中大肠菌群的测定方法2、操作步骤（3）平板菌落数的选择菌落数在15~150之间的平板计数典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。食品中大肠菌群的测定方法2、操作步骤（4）证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于10个BGLB肉汤管内，进行证实试验。36±1℃培养24~48h，凡BGLB肉汤管产气者，所对应的菌落即为大肠菌群阳性菌落。什么样的菌落必须要做证实试验?非典型菌落，如在颜色、直径与典型菌落不符合的菌落。是被检样品中含有乳糖以外的其他糖类，如牛奶、饮料等样品。食品中大肠菌群的测定方法2、操作步骤（5）结果报告例：10－4样品稀释液1ml在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取10个接种BGLB肉汤，证实6个为阳性。则样品大肠菌群数为：100××104=6.0×105cfu/g(mL)食品中大肠菌群的测定方法6103、培养基原理结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA，又称VRB或VRBL)主要成分：乳糖、胆盐、结晶紫、中性红及细菌生长所必需的营养成分如:蛋白胨、酵母膏等。中性红为VRBA的指示剂系统，在酸性条件下为紫红色。大肠菌群分解乳糖所产生的酸与胆盐结合，可形成沉淀。制备注意：使用前临时制备，不需高压灭菌，煮沸2min（杀死培养基中可能污染的少量细菌，特别是G－，恩VRBA不需高压，胆盐可抵制G+生长。对于其它不需高压的培养基