荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程

.实用文档.文件名称AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程颁发部门制订人：复核人：批准人：质保部制订日期：复核日期：批准日期：执行日期版本1.0编号SOP04006制作份数 份发送部门修订记录修订人修订原因修订内容版本修订日期.目的：确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、标准化。.范围：适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。.定义：无.职责：荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。质保部对本规定的有效执行承当监督检查责任。.内容：室内温度控制在15〜30℃,相对湿度45〜75%。仪器操作依次翻开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。接着翻开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。点击7500Softwarev2.3图标，翻开软件。按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反响管或者96孔PCR反响板放入检测孔位，记下放置位置。检测8联PCR反响管用**反响孔模块，检测96孔PCR反响板用**反响孔模块。〔检测8联PCR反响管需放入盖紧管盖的空8联PCR反响管配平，检测96孔PCR反响板无需配平〕再次按压托盘使其滑入仪器。新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63-62的模板，扩增参数是95°,10'；〔95°,10"；63°,45"〕x5cycles；〔95°,10"；62°,35"〕x40cycles,在62°时收集荧光信号〔HEX、FAM信号〕，.实用文档.203反响体系。在Setup-PlateSetup-DefineTargetsand521^版中，将TargetName下的Targetl改成FAM；点击AddNewTarget将新增的Target1改成HEX,点击Reportee下拉菜单，选择VIC。在Setup-RunMethod-GraphicalView中的ReactionVolumePerWell后面输入20〔20川反响体系〕。选中第一个HoldingStage，点击DeleteSelected删除；在CyclingStage中的NumberofCycles后输入5,在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度63度，输入时间45秒，将63度下面收集荧光图标点掉；点击AddStage下拉菜单项选择择Cycling，在CyclingStage中的NumberofCycles后输入40，在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度62度，输入时间35秒，在62度下面点击图标收集荧光。点击Save下拉菜单下的SaveAsTamplate，文件名输入UG-63-62，保存在默认ab7500-config-tamplates文件夹内，关闭设置界面。已有扩增参数模板：在软件Home界面中点击Template,选择需要的模板，点击翻开。例如：UG-63-62，其扩增参数就是95°，10'；〔95°，10"；63°，45"〕x5cycles；〔95°，10"；62°，35"〕x40cycles，在62°时收集荧光信号〔HEX、FAM信号〕，ReactionVolumePerWell:20|jl〔203反响体系〕。在Setup-PlateSetup-AssignTargetsandSamples中选择8联管摆放的位置，全部勾选Sample1；UGT1A1*6勾选HEX，UGT1A1*28勾选FAM。在Run-AmplificationPlot中点击STARTRUN,命名为20210101-1〔当日日期+当日上机次数，例：2021年1月1日第1次上机编号为20210101-1〕，保存在默认文件夹中，开始运行。结果分析PCR反响结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析。也可根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以〔用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3〜15、End值可设在5〜20〕，Threshold值〔Rn〕推荐设定为5000〜15000，点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录每个反响的Ct值。实验结束后取出反响管〔切勿翻开管盖〕，顺序关闭AB7500软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。仪器维护每周维护检查计算机磁盘空间。如需要，将实验文件归档或备份。•至少每周检查一次计算机磁盘空间。•如果硬盘的可用空间缺乏其总容量的20%，应将较陈旧的数据传输到备份存储设备上保存。5.3.1.2关闭控制7500Instrument的计算机，30秒后再次开启计算机。

.实用文档.用无绒布块〔不脱毛〕蘸取75%酒精清洁7500Instrument的外表。〔注：切勿使用有机溶剂清洁7500Instrumento〕使用75%酒精浸泡反响管托架〔晾干后放回仪器内〕。每月维护执行背景校准。〔可执行一次背景校准以检查是否存在污染物〕运行磁盘清理和磁盘碎片整理。至少每月一次。当Windows®操作系统显示消息提示执行碎片整理时。切勿同时运行磁盘管理实用工具和7500Real-TimePCRSoftware。每半年〔6个月〕维护检查灯具状态。①在7500Software中，选择Instrument-LampStatus/Replacement以确定卤素灯的状态。显示LampStatus/Replacement对话框：•Condition-表示以下其中一种状况：Good-灯具工作良好，不需要更换。单击CloseoFailed-必须更换灯具。单击Close,然后按照5.3.4.3步骤更换卤素灯。ChangeSoon-灯具使用超过2000小时；生产商建议将其更换。单击Close,然后决定是否更换灯具。如果断定更换，请按照5.3.4.3步骤更换卤素灯。Usage(Hours)-灯具已照明的总小时数。LampCurrent-灯具的输出电流，以安培为单位(A)。低电流意味着灯具可能将要失效。DateLastReplaced-上次更换灯具的日期。CurrentLampStatusCondition: GoodUsage(Hours1 0LgmpCurrent; UnknownDateLastReplaced:10/01/2007rReplaceLam|)ResetLampTimerYoumustresetthelamptimerafterreplacincjthelamp.ResetLampTimer[NOTE:Thelamptimercanonlyberesetwhentheinstrumentisidle.]②在执行一次运行之前或期间，7500Software可能显示以下警告:.实用文档.消息描述Warning-Cannotdetectsufficientcurrentfromlamp.Eitherlampisnotinstalledproperlyorneedstobereplaced.在运行开始时，灯具电流低于可接受水平。在按照5.3.4.3步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运行。Warning-Cannotdetectsufficientcurrentfromlamp.Eitherlampisnotinstalledproperlyorneedstobereplaced.7500Software停止了该次运行，因为在运行中灯具电流下降到可接受水平之下。在按照5.3.4.3步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运行。在消息框中单击OK,检查仪器日志，然后更换灯具。Warning-Thelampusagehasexceeded2000hr.Werecommendreplacingthelampsoontoensureoptimalassayperformance.在运行开始时，灯具使用时间超过2000小时。单击CancelRun，然后更换灯具，或者单击ContinueRun。重新运行ROI、背景、光学和染料校准。5.3.3.2执行目标区〔ROI〕校正。执行背景校准。执行光学校准。执行染料校准。执行RNaseP仪器验证试验。5.3.4其它维护任务〔需要时执行〕样本块污染去除。执行以下程序，去除7500Instrument样本块的荧光污染。荧光污染是导致背景运行失败的常见原因，在此情况下，一个或多个反响孔会持续表现出异常的高信号。注意！切勿移去设备上的盖板。7500Instrument中没有用户可平安维修的组件。如果疑心存在问题，请联系生产商效劳代表。①全程戴上一次性无粉手套操作。②找到样本块中受污染的反响孔〔参阅5.4.2.13”如何确定污染〃〕。③从7500Real-TimePCRInstrument中取出反响板和托盘支架。a.按压托盘门，将其翻开。b.取出反响板和托盘支架。c.关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。

.实用文档.④手动降低样本块:a,在7500Software中，选择Instrument-InstrumentMaintenanceManager。b.在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartManualCalibration。c.在ROIInspector对话框中，单击MoveBlock。d.当ROIInspector对话框显示“BlockDown”时，单击Done。⑤关闭7500Real-TimePCRInstrument,然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。⑥翻开7500Real-TimePCRInstrument的检查门。a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。⑦抬起门栓，然后将受热的护盖门推到仪器的反面。⑧使用少量的双蒸水，清洁样本块中被污染的反响孔:a.用移液管吸取少量双蒸水并滴入每个受污染的反响孔中。

.实用文档.b.抽吸并滴入反响孔中的双蒸水数次，以冲洗反响孔。c.将用过的双蒸水水吸入废液瓶中。d.使用棉花拭子，擦试每个被污染的反响孔的内壁。e.使用无绒布料，吸出剩余的双蒸水。⑨7500Real-TimePCRInstrument将受热的护盖门拉到仪器的正面。抬起门栓，然后将受热的护盖门紧固到交叉杆。⑩翻开⑨7500Real-TimePCRInstrument将受热的护盖门拉到仪器的正面。抬起门栓，然后将受热的护盖门紧固到交叉杆。⑩翻开7500Real-TimePCRInstrument的检查门。⑪插上电源插头并开启7500Instrumento⑫通过执行背景校准运行确认已消除污染〔参阅5.4.2”背景校准〃〕。⑬如果污染仍然存在，重复步骤②至⑦，然后使用95%乙醇溶液清洁样本块中受污染的反响孔:a.用移液管吸取少量95%乙醇溶液并滴入每个受污染的反响孔中。b.抽吸并滴入反响孔中的溶液数次，以冲洗反响孔。.实用文档.c.将用过的乙醇溶液吸入废液瓶中。重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反响孔之后，应始终使用双蒸水冲洗反响孔。⑭重复步骤⑧至⑫，以冲洗样本块的反响孔，并验证已去除掉污染物。⑮如果污染仍然存在，重复步骤②至⑦，然后使用10%漂白剂溶液清洁样本块中受污染的反响孔：a.用移液管吸取少量10%漂白剂溶液并滴入每个受污染的反响孔中。b.抽吸并滴入反响孔中的溶液数次，以冲洗反响孔。c.将用过的漂白剂溶液吸入废液瓶中。重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反响孔之后，应始终使用去离子水冲洗反响孔。⑯重复步骤⑧至⑫，以冲洗样本块的反响孔，并验证已去除掉污染物。如果仍有污染，请与生产商技术支持联系。⑰确保受热盖门完全关闭并上闩。如果没有，那么7500Software显示错误消息。移动PCR仪。〔更换或移动光学器件的任何部件后，必须执行ROI校准、背景校准、光学校准、染料校准以及RNaseP仪器验证。〕更换卤素灯。①全程戴上一次性无粉手套操作。②关闭7500Instrument，然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。a.注意！灼热。7500Instrument和灯具灼热！灯具在使用中会变得非常灼热。在处理灯具之前，应允许灯具冷却15分钟，并戴上无粉防护手套。b.重要！为防止灼伤及缩短新灯具的使用寿命，处理灯具时请戴上一次性无粉手套。c.注意！7500Instrument按设计仅可使用12V、75W的卤素灯。③翻开7500Instrument的检查门。a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。b.翻开仪器前门。

.实用文档.④从仪器中取出灯具：a.向下滑动灯具释放杆。b.用手紧紧地抓住卤素灯并向上提，使灯具从安装槽口中脱出。⑤查看灯具并确定有无故障迹象〔有故障的灯具内壁上通常有碳黑层〕。⑥将新灯具安装至仪器上:

.实用文档.a.向上滑动灯具释放杆。⑦关闭仪器前门。⑧插上电源插头并开启7500Instrumento⑨翻开ROIInspector对话框：a,在7500Software中，选择Instrument-InstrumentMaintenanceManager。b.在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartManualCalibration。⑩在ROIInspector对话框中，选择LampControl-Idle。当仪器运行时，通过检查门上的缝隙观察，确保灯具发光，然后单击Doneo.实用文档.⑫如果灯具发光，在7500Software中选择Instrument-LampStatus/Replacement,单击ResetLampTimer，然后单击OK。如果灯具不发光，那么替换的卤素灯可能有缺陷。重新更换灯具。如果再次更换灯具后仍不发光，检查仪器的保险丝是否存在故障〔参阅第71页〕。⑬更换灯具后，按顺序执行以下校准。请参阅：5.4.1目标区〔ROI〕校准5.4.2背景校准5.4.3光学校准5.4.4染料校准5.4.5验证仪器性能更换7500Instrument保险丝。①保险丝损坏时，更换7500Real-TimePCRInstrument保险丝。〔注意！为在长时间内防止火灾，更换保险丝时请使用类型和额定值与仪器原始保险丝相同的经认可的保险丝。〕②全程戴上一次性无粉手套操作。③关闭仪器电源，并拔下电源插头。④使用平口螺丝刀从仪器上旋松并卸下保险丝座。⑥使用12.5A、250V、5X20mm保险丝更换损坏的保险丝。

.实用文档.注：电压和电流额定值见保险丝座。⑦安装保险丝座。⑧插上电源插头，然后开启仪器。如果仪器接通了电源，说明保险丝已安装成功。注：保险丝损坏可能是由仪器供电电源波动导致。为了防止继续出现故障，可以考虑安装电气保护设备，例如UPS或其他电涌保护器。更新Windows®操作系统。更新7500Software。监控仪器状态〔使用FunctionTest对话框对主要7500Instrument组件执行高级诊断。一般情况下不需要执行功能测试，除非疑心有硬件故障，或者LifeTechnologies代表指示这样做。〕①在7500Software中，选择Instrument-Function-Test。②根据需要执行功能测试。要测试：所有组件-单击AllTests然后等候软件执行所有功能测试。一个或多个特定组件-单击以下其中一项或多项。USB-测试7500Real-TimePCRInstrument和计算机之间的通用串行总线(USB)连接。如果7500Software能够和7500Real-TimePCRInstrument建立通信，那么表示测试通过。CCD-测试7500Real-TimePCRInstrument内的CCD摄像机。如果摄像机能够拍摄图像，那么表示测试通过。FilterWheel-测试7500Real-TimePCRInstrument内的过滤轮。如果过滤轮控制器运行正确版本的固件，那么表示测试通过。Shutter-测试7500Real-TimePCRInstrument的光学快门。如果快门控制器运行正确版本的固件，那么表示测试通过。Lamp-测试7500Real-TimePCRInstrument的卤素灯。如果灯具控制器运行正确版本的固件，那么表示测试通过。ThermalCycler-测试7500Real-TimePCRInstrument内的热循环仪样本块。如果热循环仪的控制器运行正确版本的固件，那么表示测试通过。

.实用文档.当7500Software完成一项测试时，软件报告该测试的通过/失败状态，并提供结果描述。③结束测试时，单击Close。5.4仪器校准目标区〔ROI〕校准全程戴上一次性无粉手套操作。从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反响板。让ROI校准反响板温度上升至室内温度〔约需5分钟〕。在立即运行反响板之前，不要从包装袋内取出ROI校准反响板。反响孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间曝光可降低染料在反响板中的荧光。从包装袋中取出ROI校准反响板。将光学薄膜留在反响板上。不要丢弃存放ROI校准反响板的包装袋。假设贮存于原始包袋中，反响板最多可重复使用三次。振荡ROI校准反响板5秒钟。用板式离心机将反响板离心2分钟。ROI校准反响板必须充分混合并离心。确认ROI校准反响板每个反响孔中的液体均位于反响孔底部。如果不是，那么以更高的转速及更长的时间离心反响板。按压托盘门，将其翻开。将反响板装入仪器中的反响板架。确保放置时反响板在反响孔板适配器中被正确对齐。〔装入标准反响板，使A12凹口位置位于托盘的右上角。〕以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。执行自动ROI校准①在7500Software中，选择Instrument-InstrumentMaintenanceManager。②在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartCalibration。.实用文档.③按照向导的指示，完成校准。ROICalibration对话框显示三个选项卡：Setup-显示ROI校准设置说明。单击Next提示可以翻开Run选项卡。Run-单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以翻开Analysis选项卡。Analysis-指明校准状态〔Passed/Failed〕。如果校准失败，请参阅5.4.1.13"排除ROI校准故障〃。5.4.1.11执行手动ROI校准①在7500Software中，选择Instrument-InstrumentMaintenanceManager。②在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartManualCalibration。③在ROIInspector对话框中〔如图1〕：a.在ExposureTime字段中，输入2048。b.选择FilterA〔滤光器1〕。图1④单击Snapshot,生成一张ROI图像。⑤确定ROI图像是否可接受〔下列图所示为未饱和以及过饱和的图像〕。可接受图像中的反响孔：•在不过饱和的前提下，必须尽可能明亮。〔生成ROI校准时，如果反响孔过饱和，那么显示一条警告。〕•可以含有但不是必须含有红色像素〔表示饱和〕。未饱和正常饱和过度饱和

.实用文档.⑥如果ROI图像可接受，转至步骤⑦。如果ROI图像过饱和，将ExposureTime降低一半，然后单击Snapshot。重复执行，直至获得可接受的ROI图像。如果无法获得可接受的图像，请参阅5.4.1.13"排除ROI校准故障〃。⑦单击GenerateCalibrationo7500Software采集一张截图，然后显示一个消息框或ROI图像：如果软件显示： 执行：

.实用文档.注：绿色圆圈表示反响孔位置的目标区已足够亮。Pi-elIntense138WdkFwjndEG成功校准-WellsFound.实用文档.注：绿色圆圈表示反响孔位置的目标区已足够亮。Pi-elIntense138WdkFwjndEG•在ROI图像上每个反响孔区的周围显示绿色圆圈。⑧单击SaveCalibration。软件保存滤光器1新产生的ROI校准。在ROIInspector的FilterMasksLoaded区域,“OK〃出现在滤光器1旁边。LED匚rrJiol■三E邛口reTrr上LanxiGatrd1/rfirr■bAomFig：LED匚rrJiol■三E邛口reTrr上LanxiGatrd1/rfirr■bAomFig：「Arb「C「D冷介日用133Foil'd'SGnaphrJGcyl5Kjl近^S占,t匚s匕FiferHali.cLoaded向咏&:QK口口OKE:QK口即（当所有滤光器的FilterMasksLoaded都是OK时，校准完成。⑩点击Done。5.4.1.12拆卸反响板〔注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100°C。假设刚使用过仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。〕①取出校准反响板：a.按压托盘门，将其翻开。b.取出校准反响板。.实用文档.c.按压托盘门，将其关闭。②将校准反响板放入其包装套中。如果要执行背景和光学校准：a.在接下来的8小时，将ROI校准反响板置于室温下。光学校准使用ROI校准反响板。b.第二天将放入包装套的反响板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。c.重要！不要丢弃校准反响板。如果将反响板装在其原始包装套内贮存，在翻开其包装后最多可重复使用反响板3次。d.重要！执行ROI校准后，也必须执行背景校准、光学校准、染料校准以及仪器验证。5.4.1.13排除ROI校准故障问题/病症可能原因行动ROI校准失败样本块可能位于降低的位置。1.如果ROIInspector的CCDControl/Settings显示“BlockROI图像模糊Up〃，那么单击BlockUp将样本工块升高。**1向前拉出，以确保托盘可以利安装了受热盖栓，检查确1 x■ CCDCxrrfnBi/Sellr-asI Eva!-iieTni«[iff5| |lQ24-引I L4fttpCOillOi1 |if“ 叱w |一■ C-scJwpiwssFim| Flee帚出2.检查确认受热的盖组件已被全年被正确推入。如果7500Instrume认盖栓处于锁定位置。3.如果ROI校准仍状态〔参阅5.3.3.1更换灯具〔参阅5.■^31里7500Instrument内的卤素灯t态〃〕，然后，如果需要时，谏灯〃〕。L5^然失败，检查:“监控灯具状3.4.3“更换卤5.4.2背景校准全程戴上一次性无粉手套操作。从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出准备好的背景反响板。.实用文档.让背景反响板温度上升至室温〔至少需要5分钟〕。从包装袋中取出背景反响板。〔重要！不要丢弃存放反响板的包装袋。假设将背景反响板贮存在其原始包装套内，背景反响板最多可重复使用三次。〕振荡反响板5秒钟。用板式离心机将反响板离心2分钟。反响板必须充分混合并离心。确认反响板每个背景反响孔中的液体均位于反响孔底部。如果不是，那么以更长的时间离心反响板。按压托盘门，将其翻开。将反响板装入仪器中的反响板架。确保放置时反响板在反响孔板适配器中被正确对齐。以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。〔注：如果无法翻开托盘，样本块可能位于其“升高〃位置，锁定了托盘门位置。要降低样本块，选择 Instrument-Calibrate,然后退出ROIInspector。〕在7500Software中，选择Instrument-InstrumentMaintenanceManagero在InstrumentMaintenanceManager中，选择Background选项卡。在Background选项卡中，单击StartCalibrationo按照向导的指示，完成校准。BackgroundCalibration对话框显示四个选项卡：,Overview-显示校准相关信息。Setup-显示背景校准设置说明。单击Next提示可以翻开Run选项卡。Run-单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以翻开Analysis选项卡。,Analysis-指明校准状态(Passed/Failed)。如果校准失败，请参阅5.4.2.12“排除背景校准故障〃。注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间〔最多可达10分钟〕，以允许受热的护盖到达正确温度。校准完成后，取出校准反响板：①按压托盘门，将其翻开。②取出校准反响板。③按压托盘门，使其滑入仪器。将校准反响板放入其包装套内，并将包装好的反响板放回冷冻柜内的光谱校准套件中。〔重要！不要丢弃校准反响板。如果将反响板装在其原始包装套内贮存，在初次翻开其包装后最多可重复使用反响板3次。〕排除背景校准故障问题/病症可能原因行动.实用文档.背景校准失败背景反响板上的一个或多个反响孔产生的光谱超过仪器的最高限度。.使用相同的背景反响板重复执行校准。.假设校准再次失败，请使用另一不同的背景反响板重复执行校准。.假设校准再次失败，请按下文“如何确定污染〃的说明，确定污染源。如何确定污染假设信号超过正常背景荧光的限度，那么说明校准反响板或样本块上存在荧光污染物。常见污染物包括记号笔中残存的油墨、一次性手套洒落的粉末及灰尘。欲确定污染来源和位置：①在查看原始数据时，选择反响板布局中数块连续的较小区域，以找出受污染反响孔的位置。②将背景反响板旋转180°,然后再次执行背景校准。③重复步骤①以找出污染物的位置。如果步骤①和③中找到的包含污染物的反响孔位置：相同-那么说明样本块中含有污染物。请按照“5.3.4.1样本块污染去除〃的说明，除去样本块中的污染物。相反-那么说明背景反响板中含有污染物。丢弃当前使用的背景反响板，并使用新背景反响板执行背景校准程序。如果更换背景反响板并且取出样本块的污染后校准失败：④将用黑纸覆盖的反响板装入7500Instrumento⑤按照本章的说明，执行背景校准程序。⑥校准完成后，选择反响板布局中的所有反响孔。⑦查看光谱图谱中的峰值。如果峰值：可见-那么说明7500Instrument的光学部件可能已被污染。请与生产商联系。不存在-那么说明样本块已被污染。请按照“5.3.4.1样本块污染去除〃的说明，除去样本块中的污染物。光学校准全程戴上一次性无粉手套操作。从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反响板。让ROI校准反响板温度上升至室温〔至少需要5分钟〕。从包装袋中取出ROI校准反响板，振荡反响板5秒钟。〔重要！不要丢弃存放反响板的包装袋。假设将ROI校准反响板贮存在其原始包装套内，ROI校准反响板最多可重复使用三次。〕.实用文档.〔如果执行ROI校准后，将ROI校准反响板保持在室温，那么跳到步骤5.4.3.5,以减少在反响板在室温时形成的冷凝。如果ROI校准反响板位于冷冻柜中，转至步骤5.4.3.2。用板式离心机将反响板离心2分钟。ROI校准反响板必须充分混合并离心。确认ROI校准反响板每个反响孔中的液体均位于反响孔底部。如果不是，那么以更长的时间离心反响板。按压托盘门，将其翻开。将反响板装入仪器中的反响板架。确保放置时反响板在反响孔板适配器中被正确对齐。以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。在7500Software中，选择Instrument^InstrumentMaintenanceManagero在InstrumentMaintenanceManager中，选择Optical选项卡。在Optical选项卡中，单击StartCalibration。按照向导的指示，完成校准。OpticalCalibration对话框显示四个选项卡：,Overview-显示校准相关信息。Setup-显示光学校准设置说明。单击Next提示可以翻开Run选项卡。Run-单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以翻开Analysis选项卡。,Analysis-指明校准状态(Passed/Failed)。如果校准失败，请参阅5.4.2.12“排除背景校准故障〃。注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间〔最多可达10分钟〕，以允许受热的护盖到达正确温度。取出校准反响板：①按压托盘门，将其翻开。②取出校准反响板。③按压托盘门，使其滑入仪器。将校准反响板放入其包装套中。将放入包装套的反响板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。〔重要！不要丢弃校准反响板。如果将反响板装在其原始包装套内贮存，在翻开其包装后最多可重复使用反响板3次。〕染料校准全程戴上一次性无粉手套操作。从冷冻柜中取出光谱校准套件，并从套件内取出所有染料反响板。将光谱校准套件放回冷冻柜贮藏。让染料反响板温度上升至室内温度〔约需5分钟〕。〔重要！在立即运行之前，请勿从包装袋内取出染料反响板。在每个染料反响板上，反响孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间暴露在光线中会降低反响板的荧光信号强度。〕.实用文档.注：如果将7500Real-TimePCRInstrument染料反响板贮存在其原始包装内并放在冷冻柜中，那么在翻开包装后6个月内可以校准7500Real-TimePCRInstrument最多3次。在7500Software中，选择Instrument^InstrumentMaintenanceManagero在InstrumentMaintenanceManager中，选择Dye选项卡。在Dye屏幕上，选择SystemDyeCalibration。单击StartCalibrationo按照向导的指示，完成每个反响板的校准。〔重要！在每个校准中，向导将单独指示。必须独立设置、运行和分析每个染料反响板。〕DyeCalibration对话框显示四个选项卡：Overview-显示校准相关信息。当软件提示获取需要的材料时，选择要校准的染料。Setup-显示染料校准设置说明。单击Next提示可以翻开Run选项卡。当软件提示装入染料反响板时，按照步骤5.4.4.10所述准备并装载反响板。Run-单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以翻开Analysis选项卡。Analysis-指明校准状态(Passed/Failed)。当软件提示分析从每个染料反响板采集的光谱时，核实校准的状态：Passed—7500Instrument校准通过。转到步骤5.4.4.11的②。Failed—7500Instrument校准失败。请参阅5.4.4.15“排除染料校准故障〃。注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间〔最多可达10分钟〕，以允许受热的护盖到达正确温度。将软件所需的染料反响板从其包装中取出。振荡反响板5秒钟。〔重要！不要丢弃存放反响板的包装袋。假设贮存于原包袋中，反响板最多可重复使用3次。用板式离心机将反响板离心2分钟。反响板必须充分混合并离心。确认反响板每个背景反响孔中的液体均位于反响孔底部。如果不是，那么以更长的时间离心反响板。检查并确保要装入的染料反响板与在7500Software中选取的荧光匹配。按压托盘门，将其翻开。将反响板装入仪器中的反响板架。确保放置时反响板在反响孔板适配器中被正确对齐。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。〔注：如果无法翻开托盘，样本块可能位于其“升高〃位置，锁定了托盘位置。要降低样本块，选择Instrument-Calibrate,然后退出ROIInspector。〕因为向导对每个染料校准单独提供指示，所以请对校准的每个染料执行以下程序。.实用文档.打的陋net蝮②b③①②a工用心1.实用文档.打的陋net蝮②b③①②a工用心1,iriMriiciwMH-R5伯力fit- 『柞浒a母川te慌，“外口口a配配口tilth'Ha-riouoiun*.Re«mig甘日e都Miftwcaibfaian口端鸵配L优片等口，Re轴।博"io后孑将由丁琳以graUonresult<J期面词Plat电L*悝ut[WMTmb监IaaMriI|Pnmq1怪才Anal^zbDab[)she*-InWalk;¥ijIgtaLsgand毒Dye-iCdrlibrdxm-nr-OrEWiew①验证校准状态：,Passed—7500Instrument校准通过。转到b〕。•Failed—7500Instrument校准失败。请参阅5.4.4.15“排除染料校准故障〃。②核实染料光谱的分组：a.在反响板布局中，选择反响板的孔。b.检查原始数据。对于每个光谱，请确认峰值：,位于7500Instrument的可检测范围内。,无不规格光谱峰值。,出现在染料的正确通道上。如果某光谱不符合上述标准，请参阅5.4.4.15“排除染料校准故障〃。注：在含有相同染料的各反响孔中，光谱位置和峰值位置的差异是由于不同反响孔之间的光学属性及激发能存在细微差异而引起的。③假设所有光谱均可接受，那么单击Next。5.4.4.12取出校准反响板：〔注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100°C。假设刚使用过仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。〕①按压托盘门，将其翻开。②取出校准反响板。③按压托盘门，将其关闭。④将校准反响板放入其包装套中。将放入包装套的反响板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。〔注：如果将7500Real-TimePCRInstrument染料反响板贮存在其原始包装内并放在.实用文档.冷冻柜中，那么在翻开包装后6个月内可以校准7500Real-TimePCRInstrument最多3次。〕5.4.4.13在按照指示将染料反响板取出后，单击Finisho滤光器峰值(nm)染料/光谱1-520FAM染料 SYBRGreen染料101\ 1 \稣J “L 〔। 2 * 4 口 i ； 。 ， 西2-550JOE染料 VIC染料!j/\ll/\Jdi-1 1 1 L - ” “ uui ! 3 il 12 3 4 6F^Ihf CiHKr3-580CY3染料 NED染料 TAMRA染料i-八3 5 < fl •[2 34 B 1 3 3 -1 JMw Fmm mm4-610ROX染料 TEXASRED染料|!/\i；A12 3 4 5 12^4-5FBisr FifHotf5-670CY5染料5.4.4.14按照5.4.4.1开始操作，准备并运行下一个反响板。.实用文档.问题/病症可能原因行动一个或多个原始光谱到达或低于校准的可检测阈值。•光谱校准反响板未充别离心。•光谱校准反响板含有陈旧试剂或试剂体积缺乏。•假设正运行定制光谱校准反响板，染料可能浓度缺乏。1.卸载7500Instrument并查看光谱校准反响板的反响孔。假设反响孔中的液体不是：-位于反响孔底部，请将反响板离心更长时间，然后重复执行校准。-体积相等，那么说明反响板未密封致使试剂挥发。请将其丢弃，并运行另一反响板。.假设光谱校准反响板显示正常，那么丢弃该反响板并运行另一块反响板。.如果问题依然存在，请与生产商联系。注：假设正运行定制光谱校准反响板，请创立另一反响板但要增加产生缺乏信号的染料的浓度。一个或多个原始光谱超过7500Instrument的最高限量。•样本块或光谱校准反响板含有荧光污染物。•假设正运行定制光谱校准反响板，染料可能浓度过大。请按照5.4.2”背景校准〃操作，以确认是否存在污染物。假设背景校准未显示样本块含有污染物，那么光谱校准反响板可能含有污染物。注：假设正运行定制光谱校准反响板，请创立另一反响板但要降低超过可检测限量的染料的浓度。光谱在一个以上的滤光器中含有峰值。样本块或光谱校准反响板含有荧光污染物。5.4.5验证仪器性能全程戴上一次性无粉手套操作。冷冻柜中取出TaqMan®RNaseP96-WellInstrumentVerificationPlate，然后让反响板温度上升到室温〔大约需要5分钟〕。从包装袋中取出RNaseP反响板。振荡反响板5秒钟。用板式离心机将反响板离心2分钟。反响板必须充分混合并离心。确认液体位于反响板每个反响孔底部。如果不是，那么再次以更长的时间离心反响板。〔重要！注意不要让RNaseP反响板的底部染上尘污。反响板底部沾上的液体和其它污染物可污染样品区组，导致异常高的背景信号。〕.实用文档.上图为RNaseP反响板上标准和未知种群的分布情况。RNaseP反响板包括五个重复组的标准物〔1250、2500、5000、10,000和20,000拷贝〕、两个未知重复组〔5000和10,000拷贝〕和阴性对照反响孔(NC)。按压托盘门，将其翻开。将反响板装入仪器中的反响板架。确保放置时反响板在反响孔板适配器中被正确对齐。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。开始运行反响板：在7500Software中，选择Instrument-InstrumentMaintenanceManager。在InstrumentMaintenanceManager中，选择RNaseP选项卡。在RNaseP屏幕，单击StartRNasePRun。按照向导的指示，完成校准。RNaseP对话框显示四个选项卡：,Overview-显示校准相关信息。Setup-显示RNaseP运行设置说明。单击Next提示可以翻开Run选项卡。Run-单击STARTRUN可以开始运行流程并显示处理消息。单击 Next提示可以翻开Analysis选项卡。,Analysis-指明运行状态(Passed/Failed)。注：开始运行之前，仪器可能暂停〔最长10分钟〕，以允许受热的护盖到达正确温度。注：7500Software完成RNaseP运行后，会自动分析运行，并在Analysis屏幕显示结果。在RNasePR