实验四外源基因的多重检测

实验四外源基因的多重检测第一页，共二十页，2022年，8月28日实验目的通过多重PCR，比较、分析影响多重PCR的主要因素，掌握解决方法。掌握多重PCR引物设计的原则和方法，确立多重PCR方法快速检测转基因植物中外源基因整合的条件，为更深一步应用多重PCR检测技术奠定基础第二页，共二十页，2022年，8月28日一多重PCR技术的基本原理

多重PCR方法目前在植物生物学研究上应用非常广泛，包括植物种质鉴定，植物病毒的检测和分子育种。多重PCR的关键是引物设计，主要原则就是避免引物内部形成发卡结构，引物及引物之间在扩增过程中产生二聚体。其他条件例如模板纯度，退火温度也能够影响PCR扩增效果。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。第三页，共二十页，2022年，8月28日二PCR的反应动力学

DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示每次扩增效率的平均值，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期(Plateau)。第四页，共二十页，2022年，8月28日平台期产生的因素

①dNTP和引物浓度下降②酶与模板的比例下降，能参与反应的酶分子数下降③多次循环后酶与dNTP的稳定性下降④非特异产物及引物二聚体比例增加⑤产物浓度高时变性不完全，影响引物的延伸，并产物浓度过高>10－8M时，降低Taq酶的延伸与加工能力。第五页，共二十页，2022年，8月28日第六页，共二十页，2022年，8月28日设置变性-退火-延伸三个温度点设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸第七页，共二十页，2022年，8月28日第八页，共二十页，2022年，8月28日①变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性若低于93℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败第九页，共二十页，2022年，8月28日②退火(复性)温度与时间退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想第十页，共二十页，2022年，8月28日引物的复性温度

通过以下公式帮助选择合适的温度Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合第十一页，共二十页，2022年，8月28日③延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些第十二页，共二十页，2022年，8月28日

引物设计第十三页，共二十页，2022年，8月28日引物设计根据bt，nptII和gus序列特征，使用oligo6.67结合primerpremier5.0软件设计三对引物，用于多重PCR和单重PCR扩增。引物参见表1。表1扩增DNA模板引物对的方向、长度、Tm值、GC含量以及理论上扩增产物的大小等相关参数Amplifiedgene扩增基因Polarity方向Name名称primersequence引物序列Lengh长度TmTm值GC%GC含量Productsize(bp)产物长度Bt+Bt-F5'aacggtagattcgctggat3'1954.547.4247-Bt-R5'cagaagttccagagccaag3'1952.752.6NptII+NptII-F5’tccggccgcttgggtggaga3’2059.858.3449-NptII-R5’tggcgcgagcccctgatgct3’2058.758.8Gus+GUS-F5’gcaactggacaaggcacta3’1953.952.6668-GUS-R5’agcgtcgcagaacattaca3’1954.747.4第十四页，共二十页，2022年，8月28日常规引物对不适于多重PCR检测，因为扩增过程中引物之间的干扰，产物片段长度的重叠都会影响多重PCR的准确性。为了防止在PCR过程中产生非特异性扩增，每对引物的设计都应当有相近的Tm值，GC%含量和长度，产物大小能够保证相差大于150bp，这样可以在琼脂糖凝胶电泳时产生可以区分的条带。引物产生的发卡结构及二聚体的形成检测由程序(.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfoldsimple.html)完成。第十五页，共二十页，2022年，8月28日检测三个外源基因是否整合在基因组中反应体系：三对引物应用于PCR扩增反应中，体系30μL，含10×PCRbuffer3μL，dNTPmixture(2.5mM)2.5μL，，引物(5μM)各2μL，模板DNA(50ng/μL)2μL，Taq酶(5U/μL)0.3U，双蒸水补足30μL。时间设置94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃保持45s，共运行30个循环；72℃延伸10min，梯度PCR采用如下设置：94℃预变性5min；94℃变性30s，55～65℃30s，72℃保持45s，共运行35个循环；72℃延伸10min，确定最佳的退火温度，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。第十六页，共二十页，2022年，8月28日10×PCRbuffer3μLdNTPmixture(2.5mM)2.5μL引物(5μM)各2μL模板DNA(50ng/μL)2μLTaq酶(5U/μL)0.3U双蒸水补足至30μL梯度PCR采用如下设置：94℃预变性5min；94℃变性30s，55～65℃30s，72℃保持45s，共运行35个循环；72℃延伸10min。本次实验时间设置94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃保持45s，共运行30个循环；72℃延伸10min，检测三个外源基因是否整合在基因组中反应体系：第十七页，共二十页，2022年，8月28日扩增条件设置样品：待测转基因植物DNA阳性对照：质粒DNA阴性对照：未转化的同一无性系植株多重PCR反应条件94℃预变性3min94℃变性30s58℃复性45s