分子生物学研究方法朱玉贤

分子生物学研究方法朱玉贤第1页/共108页第一节基因操作的主要技术原理

1．核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)

将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。第2页/共108页第3页/共108页

在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidiumbromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。

DNA的脉冲电场电泳技术:PFGE-Pulse-fieldgelelectrophoresis第4页/共108页2．核酸的分子杂交技术

在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）第5页/共108页核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：

1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleicacidblotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colonyandplaqueblotting)；

2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。第6页/共108页第7页/共108页第8页/共108页3．细菌的转化

所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（CompetentCells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。

第9页/共108页4．DNA序列分析a.Sanger的双脱氧链终止法

Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；DNA聚合酶常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP。第10页/共108页第11页/共108页双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图第12页/共108页第13页/共108页b．DNA序列分析自动化(分析反应\读片过程

)

用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后,用计算机检测。第14页/共108页DNA测序的全过程(实际)第15页/共108页5．基因的定点诱变（site-directedmutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。如：盒式诱变(cassettemutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。第16页/共108页6．利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.a.凝胶滞缓实验(Gelretardationassay)，又称DNA迁移率变化试验(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。

第17页/共108页b．DNaseI印迹试验（DNaseIfootprinting）主要步骤：

①用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；

②加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；

③加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。

这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断裂！

④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；

⑤进行DNA凝胶分析。

如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出现了一个空白的区域,形象地称为足迹。第18页/共108页7.PCR技术（基因的体外扩增法）(1).概念

PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。

经过n轮PCR扩增循环,理论上可以得到2n个新生的DNA分子。特别注意：第19页/共108页(2).一个PCR体系的基本组成超纯水缓冲液Mg2+dNTPsDNA模板引物TaqDNA聚合酶第20页/共108页(3).PCR(聚合酶链式反应)基本原理第21页/共108页(4).PCR的主要步骤①.高温变性在高温（93-95℃）下，待扩增的双链DNA模板受热变性成为两条单链DNA模板。②.低温退火在低温（37～60℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链。③.适温延伸在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以引物3’-OH端为合成的起点，以脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料，按5’→3’方向延伸,合成单链DNA模板的互补链。第22页/共108页(5).PCR的主要步骤小结

每一双链DNA模板，经过一轮变性（解链）、退火、延伸3个步骤的热循环后就成了两个双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所得到的双链DNA（PCR产物）均能成为下一次循环的模板，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使DNA模板扩增到109倍以上，实际上一般可达106～107倍。第23页/共108页生物技术工程基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程第24页/共108页重组DNA技术发展史上的重大事件

第25页/共108页1869

FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T.Avery证实DNA是遗传物质。1952A.D.Hershey和M.Chase再次证实噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957

A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1958

M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。第26页/共108页1972-1973

H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于1972年获得第一个重组DNA分子，1973年Cohen第一例成功的克隆实验：完成第一例细菌基因克隆。1975-1977

F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977

年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。1978

首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1980

美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981

R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。第27页/共108页1982

美、英批准使用第一例基因工程药物—重组人胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983

获得第一例转基因植物。1984

斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1985

出现第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼1988

J.D.Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。1989

DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--“Oncomouse”。1992

欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)第28页/共108页1993-1994

第一批基因工程西红柿在美国上市。1996

完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997

英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26

科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息第29页/共108页基因工程中常见的名词:①遗传工程--geneticengineering，②基因操作--gonemanipulation，③基因克隆--gonecloning④重组DNA技术--recombinantDNAtechnology⑤分子克隆--molecularcloning。第30页/共108页

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是指将外源基因经过剪切加工，再插入到一个具有自我复制能力的载体DNA中，就得到重组DNA，再将重组DNA转移到一个寄主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因所携带的新特性。

第二节基因工程第31页/共108页2.基因工程的基本程序及技术特点：

①基本程序：

分—切—接—转—筛

第32页/共108页基因工程的基本程序第33页/共108页第34页/共108页②技术特点：

1.可在体外根据需要进行人工的、有目的的基因重组、表达、测序、诱变、修复；

2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。第35页/共108页3.基因工程的主要技术DNA、RNA的分离纯化凝胶电泳技术PCR技术DNA合成技术DNA重组微生物的培养、保存酶切鉴定

DNA测序分子杂交第36页/共108页

4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多细胞的高等生物个体水平上，是指由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。⑵在细胞水平上，是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。⑶在分子生物学上，是指将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之永久保存和复制的过程。第37页/共108页亚克隆的概念

是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。第38页/共108页

基因克隆是指应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量相同的DNA分子拷贝。第39页/共108页4.2基因克隆示意图第40页/共108页二.基因工程的要素及实施第41页/共108页（一）、工具酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切割DNADNA连接酶通过生成3′,5′-磷酸二酯键,把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ探针标记、从3′-OH端补平双链ＤＮＡ中的缺口反转录酶以RNA链为模板，进行cDNA合成多核苷酸激酶5′－ＯＨ磷酸化、探针标记末端转移酶在双链核酸的末端3′－ＯＨ加上多聚单核苷酸碱性磷酸酶切除5′末端磷酸基1.常用的工具酶的功能：酶类名称功能第42页/共108页

阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年度诺贝尔生理学和医学奖.2.一把特殊的剪刀

——限制性内切酶的发现第43页/共108页3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)的分类、作用及命名作用：识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名（举例）EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)第44页/共108页3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)的识别和切割识别和切割位点：回文结构4～6bp出现两种末端：粘性末端（粘端）

平头末端（平端）

产生了平头末端产生了粘性末端第45页/共108页粘性末端与平头末端第46页/共108页4.修饰与限制作用第47页/共108页

活性：①5′→3′聚合酶活性：

②核酸外切酶活性：5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性

DNApolⅠ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段（Klenow片段）具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，是常用的工具酶。5.DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)第48页/共108页6.DNA连接酶第49页/共108页第50页/共108页7碱性磷酸酶的脱磷酸作用第51页/共108页8.同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点。9.同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端。第52页/共108页10末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)

第53页/共108页（二）、载体（vector）1.本质：DNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达2.克隆载体的种类：原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）等真核载体：动物病毒载体pLXSN等第54页/共108页3.载体的基本要求：

①.复制单位;

②.克隆位点(多个单克隆位点);

③.筛选标记;

④.分子量尽可能小;

⑤.外源DNA插入后不影响载体本身的复制能力.

没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造.

第55页/共108页

4.常用的克隆载体Ⅰ：质粒质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。第56页/共108页从天然质粒到质粒载体第57页/共108页*大小2~10kb；*优点：易于操作、保存；*缺点：转化效率较低；*转化方法：化学法电转移法*应用：a.小基因组的克隆

b.单一序列的克隆(目的基因的克隆)（1）质粒载体的一般特点：第58页/共108页（2）理想的质粒载体具有如下特点：

①拷贝数多;②两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)

、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)——筛选标志③多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiplecloningsites,MCS)第59页/共108页①pBR系列

来源于Psc101、colE1和RSF2124三个天然质粒改造重组而成。pBR322是应用最多的大肠杆菌质粒载体，用氯霉素扩增法可使质粒DNA占细胞DNA总量的50%，这对制备大量质粒DNA极为有利。（3）质粒载体举例第60页/共108页第61页/共108页第62页/共108页②pUC系列

pUC系列质粒（pUC8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的许多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。

第63页/共108页第64页/共108页（4）质粒ＤＮＡ电泳ＬOCSC第65页/共108页5.常用的克隆载体Ⅱ——噬菌体载体第66页/共108页（1）λ噬菌体(λphage)的特点：①.一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型含有双链线状DNA分子（λDNA），长度48.5kb,分子两端各有一个12bp组成的粘性末端,感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环,连接处称COS位点。②.本身有复制体系;③.感染大肠杆菌后要进行环化第67页/共108页λDNA感染大肠杆菌后的环化过程第68页/共108页④.λDNA在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高;⑤.载体容量大,可装入大片段外源DNA(20kb);⑥.可人工加入多克隆位点;⑦.筛选容易——噬菌斑筛选;⑧.主要用于DNA文库的构建.第69页/共108页（2）M13噬菌体

特点：一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb,感染大肠杆菌后,ssDNA转变为dsDNA,可用作克隆载体。

最大优点：产生单链DNA,可制备单链DNA探针。

第70页/共108页

柯斯质粒(cosmid)粘性质粒

基本结构特征:是一种人工改造的载体,双链环状DNA

组成:λDNA的cos区+质粒+控制包装作用的序列

克隆容量：31~45kb

常用的克隆载体Ⅲ——柯斯质粒第71页/共108页4.cosmid较小,约4–6kb.

5.cosmid重组体可象噬菌体一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选.1.具有λ-DNA的COS位点;

2.具有质粒的复制起点和抗药性标记(Ampr);

3.具有多种单一的酶切位点.

柯斯质粒(cosmid)的特点:

第72页/共108页cos:cohesive-endsite柯斯质粒结构图：第73页/共108页柯斯质粒的优缺点:

1.克隆效率高;

2.可利用质粒DNA的方式扩增;

3.可克隆较大DNA片段;

主要用于真核基因的克隆,基因组文库构建

4.缺点:产生串联现象。

第74页/共108页第75页/共108页YAC载体

酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色体的着丝粒和自主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒的Tel序列，选择性标志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。其他克隆载体：第76页/共108页

插入型载体——含单一的限制性酶切位点，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文库构建；

取代型载体——含某一限制性酶的两个切点，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因组DNA文库构建。经人工改造生成的基因克隆载体类型第77页/共108页目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA基因文库(genomiclibrary)—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNAcDNA文库(cDNAlibrary)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成第78页/共108页文库构建

基因组文库\cDNA文库

区别：材料

基因结构不同

文库内容

载体

使用范围第79页/共108页构建基因文库的克隆载体粘粒(Cosmid)细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体(YAC)P1噬菌体人工染色体(PAC)第80页/共108页基因文库的构建的步骤:①载体DNA的分离②真核生物DNA的分离③部分酶解④片段回收(9-23kb)⑤载体与插入片段的连接⑥包装⑦文库的效价测定⑧文库的扩增⑨文库的保存⑩重组克隆鉴定第81页/共108页第82页/共108页cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA高丰度中丰度低丰度第83页/共108页

cDNA文库的构建cDNA文库能否构建成功的关键是:

高质量的mRNA的获得一个好的cDNA文库的特征:①包含有足够大量的独立克隆，代表最初的mRNA样品中的所有转录本②克隆中包含接近全长的mRNA第84页/共108页cDNAlibraryconstructionAAAAA5’3’mRNA(allmRNAsincell)annealoligo(dT)primersof12-18basesinlengthAAAAATTTTT5’3’5’addreversetranscriptaseanddNTPsAAAAATTTTT5’3’3’5’cDNAaddRNaseH(specificfortheRNAstrandofanRNA-DNAhybrid)andcarryoutapartialdigestionAATTTTT5’shortRNAfragmentsserveasprimersforsecondstrandsynthesisusingDNApolymeraseI3’3’第85页/共108页AAAAATTTTT5’3’shortRNAfragmentsserveasprimersforsecondstrandsynthesisusingDNApolymeraseIAAATTTTT5’3’DNApolymeraseIremovestheremainingRNAwithits5’to3’exonucleaseactivityandcontinuessynthesisDNAligasesealsthegapsAAATTTTT5’3’AAAAATTTTT5’3’double-strandedcDNA第86页/共108页AAAAATTTTT5’3’NNNNNNNNGNNNNNNNNCTTAAEcoRIlinkersareligatedtobothends usingDNAligaseAAAAANNNNNNNNGTTTTTNNNNNNNNCTTAAdouble-strandedcDNAcopiesofmRNAwithEcoRIcohesiveendsarenowreadytoligateintoabacteriophagelambdavectorcutwithEcoRI5’3’AATTCNNNNNNNNGNNNNNNNN第87页/共108页第88页/共108页CIP:牛小肠碱性磷酸酶粘性末端连接法（连接效率高）和去５／磷酸连接法载体与目的基因的连接方法第89页/共108页人工接头法：第90页/共108页同聚物接尾法第91页/共108页自然界的基因转移和重组基因重组(geneticrecombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制、转录和翻译。自然界的基因转移和重组是无目的基因工程是有目的基因重组第92页/共108页结合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）转化作用(transformation)

通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程。第93页/共108页转导作用transduction病毒、噬菌体介导溶菌途径(烈性噬菌体)；溶原途径(温和噬菌体)第94页/共108页第95页/共108页将重组DNA导入宿主细胞基因工程菌

HB101,JM109转化(transformation)制备感受态细胞冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infaction)转