发光法测定菌体ATP含量

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一.实验目的

1.理解ATP的理化特性和生理功能;2.学会用荧火虫素-荧火虫素酶生物发光法定量测定ATP含量的方法;3.理解ATP生物发光原理及应用研究。第2页/共26页二.实验原理

生物发光(bioluminescence)在希腊语中表示活着的意思,在拉丁语中表示发光、发亮的意思。目前，生物发光应用最广最主要的是荧光素-荧光素酶反应发出的荧光，荧光素酶存在于荧火虫、水母一上些细菌中，它是生物内产生的一种生物反应蛋白质。第3页/共26页1.ATP生物发光工作原理

荧光素酶-ATP检测法，其化学反应的结果是把化学能转化为光能。细胞内源性的ATP含量可以反应活细胞的数量和活性。其化学反应如下：

ATP+D-L-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+ppi+O2+Light第4页/共26页第5页/共26页

当细胞受损或死亡时，其ATP值迅速下降或消失，基于这一原理，检测细胞内的ATP含量，即可反应细胞的存活状况，ATP浓度与活细胞数密切相关。检测时先将ATP与提取剂充分混合，使细胞壁和细胞膜裂解，释放ATP，再加入荧光素-荧光素酶，ATP在荧光素和荧光素酶的作用下，使其释放磷酸基团同理发出荧光，用生物荧光仪检测相对荧光强度（relativelightunits,RLU）,由此测出ATP含量，进而反映活细胞数。第6页/共26页第7页/共26页2.ATP生物发光特点优点：灵敏、快速、简便、稳定是ATP生物发光的主要优势所在，同时可以把ATP数量化，用荧光强度（RLU）把光定量，广泛应用于食品工业，医药，生物学等领域。

缺点：荧光强度和菌落形成单位（CFU）之间没有直接关系，也无法对细菌的种属进行鉴定。第8页/共26页3.应用研究检测环境是否被有害的微生物污染，食品卫生的检测和生产环境实时监测（HACCP）等。用于乳制品的检测、调味品如脱水蔬菜的细菌学的测定。第9页/共26页新药筛选及疗效评价：广泛应用于需要进行大量快速初选工作的新药筛选中。细胞免疫活性检测应用：ATP生物发光法还可测定T细胞的免疫活性。第10页/共26页三.试剂

1.荧光素-荧光酶试剂将解冻后的12mlReocnstiuttoinBueffr与荧光素酶-荧光素粉剂混合，轻轻摇晃（不能振荡）使其溶解。第一次使用前在室温下放置1h，以后只需20min左右。不用时要放置在-20ºC下保存。第11页/共26页

取0.5ml的标准ATP试剂（10-7mol/l）到5ml的容量瓶中，加入缓冲液定容，得到10-8mol/l的标准ATP试剂。用移液管取5ml的上述标准ATP试剂到50ml的容量瓶中，加入缓冲溶液定容，得到10-9mol/l的标准ATP试剂。重复以上过程，得到10-10mol/l和10-11mol/l的标准ATP试剂。

2.标准ATP试剂

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3.缓冲液

以Tris-Acetate作为缓冲液。称取一定量的Tris碱，使定容后的浓度为0.05mol/l，定容前需要先调节PH值。将PH计插入TrisI溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值为7.8，然后定容，在4ºC下保存。第13页/共26页

4.ATP提取液

采用三氯醋酸（TCA）作为ATP提取剂，浓度为0.03g/ml，在4ºC下保存。对于不同的微生物，采用不同的浓度进行提取，细菌和真核细胞的提取浓度一般为0.005-0.025g/ml，酵母真菌类则适当高一些。提取结束后，要用缓冲液将TCA的浓度稀释到一定的浓度，再进行测量，以减少TCA对反应的影响。第14页/共26页四.实验材料与仪器TD-20/20荧光光度计抽滤器及真空泵（过滤微生物进，采用0.22微米的滤膜）PH计。第15页/共26页五.操作步骤

1.ATP的提取

在测量微生物的ATP前，需要将ATP从微生物内提取出来，ATP的提取效率直接影响生物量测定结果。因此，ATP的提取也就成为ATP生物发光法测定生物量和重要步骤之一。

TCA法和加热煮沸法是两种常用的ATP提取方法。第16页/共26页TCA法TCA法是目前最常用的ATP提取方法。TCA对活细胞有两种作用：一是破裂细胞，释放ATP，二是ATP水解酶失活。提取普通微生物中的ATP时，TCA浓度为0.015g/m此浓度下，TCA对ATP与荧光素酶的生物发光反应较强的抑制作用，必须在反应前对提取液进行中和，稀释。使TCA浓度小于或等于0.001g/ml，此时TCA对反应的影响基本可以忽略。一般采用PH7.8左右的Tris-Aectate缓冲液进行稀释。第17页/共26页具体操作

取样品（如河水等，如果是固体样品需用水悬浮后取上清或匀浆）2ml置于试管中

↓↓加入2mlTCA溶液，震荡提取得3min

取1ml提取液置于50ml容量瓶中，用PH7.8的Tris-Aectate缓冲液定容稀释后的提取液置于4ºC下保存待测。↓此时TCA的浓度为0.0003g/ml，不会对反应产生影响

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加热煮沸法加热煮沸法是前期研究中采用较多的ATP提取方法。该方法先将样品中的微生物过滤出来，再将其置于缓冲液中加热煮沸提取ATP。

抽滤装置包括真空泵、滤瓶、缓冲瓶

滤膜采用0.22μm孔径的醋酸纤维滤膜

高温加热的作用主要是破碎细胞同时使细胞内ATP水解酶失活第19页/共26页

具体操作

迅速将滤膜转移到沸水浴的缓冲液中，提取5min

将装有8ml缓冲液的试管置于沸水浴中量取一定体积的样品进行抽滤

将提取液转移到10ml容量瓶，定容，试管中残留的提取液用少量Tris-Aectate缓冲液冲洗两次倒入容量瓶中

混合均匀后置于4ºC下保存待测

迅速放入冰水浴中冷却第20页/共26页

2.ATP的检测1)先用标准ATP试剂作一条标准曲线。测量得到样品的相对发光值.2)测定样品发光值,与标准曲线对比，得到样品中的ATP含量,ATP含量可以转化为微生物的浓度.

测量荧光所用的仪器是TD-20/20荧光光度计，一般将仪器的设置延迟时间设为60s第21页/共26页

标准曲线制作

在测定管中加入50μl一定浓度的标准溶液和50μl缓冲液，测定管置于样品室中，加入100μl荧光素-荧光酶反应剂后迅速盖上样品室的盖子，开始检测。

标准液浓度分别为10-7mol/l、10-8mol/l、10-9mol/l、10-10mol/l、10-11mol/l

空白值用去ATP水代替不同浓度的标准液进行测定，重复3次取平均值。第22页/共26页以ATP浓度的对数值为横坐标，荧光反应值RLUS的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。由标准曲线可见，在一定的范围内，ATP浓度与荧光反应发光值之间有较好的线性关系，样品中ATP浓度与相对发光值对应。第23页/共26页第24页/共26页样品测定及结果用50μl样品提取液代代替标准ATP试剂，具体操作与制作标准曲线一样。最后ATP浓度与微生物浓度之间的转化，是基于每个微生物包含5x10-16gATP。

注意:荧光素酶的活性衰减很快，在室温下荧光素酶试剂只能保存8h，如果测定