发酵工业无菌技术

发酵工业无菌技术第1页/共67页4.1灭菌与消毒的区别灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。第2页/共67页培养基灭菌的目的

1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果：生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难杂菌会降解目的产物；杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。第3页/共67页2，工业上具体措施包括：（1）使用的培养基和设备须经灭菌；（2）好氧培养中使用的空气须除菌处理；（3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；（4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；（5）使用无污染的纯粹种子。3，培养基灭菌的目的杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。第4页/共67页4，培养基灭菌的要求（1）达到要求的无菌程度（10-3）（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。第5页/共67页4.2发酵工业污染的防治策略4.2.1污染的危害1.使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。2.杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。3.有些杂菌会分解产物，使生产失败。4.杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。5.如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。

第6页/共67页4.2.2杂菌污染的防治杂菌的检查与类型判断显微镜检查法平板划线培养肉汤培养发酵过程的异常观察法：溶解氧水平异常变化、通过传感器或取样分析观察PH的变化、尾气中CO2异常变化污染的原因分析种子带菌、空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善分析污染杂菌的种类分析污染杂菌的时间分析污染杂菌的程度第7页/共67页杂菌污染的途径及其预防种子带菌及其预防：1.培养基及其器具彻底灭菌2.避免菌种在移接中污染3.避免菌种在培养和保藏中污染过滤空气带菌及其防治设备的渗漏或死角染菌及其防治培养基灭菌不彻底导致染菌及其防治操作不当造成染菌噬菌体染菌及其防治第8页/共67页4.3发酵工业的无菌技术工业上具体措施包括：（1）使用的培养基和设备须经灭菌；（2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；（3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；（4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；（5）使用无污染的纯粹种子。第9页/共67页灭菌的方法（1）化学法化学药品灭菌法

（2）物理法干热灭菌法湿热灭菌法射线灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法第10页/共67页4.4发酵培养基及设备管道灭菌4.4.1湿热灭菌原理湿热灭菌中的相关定义杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。第11页/共67页微生物相对热阻营养细胞和酵母细菌芽孢霉菌孢子病毒和噬菌体1.03×1062~101~5各种微生物对湿热的相对热阻湿热灭菌的优点蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。第12页/共67页4.4.1湿热灭菌的理论基础

一，培养基湿热灭菌需解决的工程问题1.将培养基中的杂菌总数N0

杀灭到可以接受的总数N（10－3），需要多高的温度、多长的时间为合理。2.灭菌温度和时间的确定取决于：（1）杂菌孢子的热灭死动力学（2）反应器的形式和操作方式（3）培养基中有效成分受热破坏的可接受范围二、微生物的热死灭动力学方程第13页/共67页

实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：N：任一时刻的活细菌浓度（个/L）t：时间（min）活菌的减少率与N的关系第14页/共67页

K：比热死速率常数（min-1）取边界条件t=0，N=N0，对（1）积分得或第15页/共67页lnN0/N=kt2.303logN0/N=ktt=2.303/klogN0/N对数残存规律工厂的经验数据，高温灭菌时间15－30s,维持8－25min。第16页/共67页培养基达到完全灭菌时，灭菌温度和灭菌时间对培养基养分破坏的比较（以VitB1为准）灭菌温度0C灭菌时间min营养成分破坏率（％）

10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.011第17页/共67页第18页/共67页4.4.2培养基灭菌的工程设计一、无菌的标准根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3。二、分批灭菌分批灭菌的设计在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。第19页/共67页第20页/共67页孢子热死亡的规律符合

积分得（8）

在分批灭菌过程中

因为升温、冷却阶段T是时间t的函数，K不是常数，所以：

式中Kh是保温阶段的孢子比热死亡速度常数第21页/共67页保证间歇灭菌成功的要素（1）内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象（2）压力稳定的蒸汽（3）合理的操作方法。发酵罐的接管图第22页/共67页培养基间歇灭菌过程中应注意的问题（1）温度和压力的关系（2）泡沫问题（3）投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上残留的问题（4）灭菌结束后应立即引入无菌空气保压三、连续灭菌的设计1，连续灭菌的流程（1）喷射加热连续灭菌喷射加热连续灭菌流程第23页/共67页典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图（2）薄板换热器连续灭菌薄板换热器连续灭菌流程第24页/共67页薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图（3）喷淋冷却连续灭菌喷淋冷却连续灭菌流程第25页/共67页连消器喷射加热器第26页/共67页薄板换热器维持罐第27页/共67页第28页/共67页第29页/共67页四、连续灭菌与间歇灭菌的比较1，连续灭菌的优缺点优点–保留较多的营养质量–容易放大–较易自动控制；–糖受蒸汽的影响较少；–缩短灭菌周期；–在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；–发酵罐利用率高；–蒸汽负荷均匀。缺点–设备比较复杂，投资较大。第30页/共67页优点–设备投资较少–染菌的危险性较小–人工操作较方便–对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点–灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。2，分批灭菌的优缺点五、影响灭菌的因素第31页/共67页

采用一台连续灭菌设备，培养液流量为18m3/h，发酵罐装料量为36m3，原始污染度为106个，要求灭菌度N＝10-3个罐，灭菌温度为398k，查图得此时得反应速度常数＝11min-1，试求维持时间t。第32页/共67页解：发酵罐培养液原有菌数：＝36×106×103×103＝3.6

×1013(个/罐）

由公式得：

t=2.303/klgN0/N第33页/共67页（1）培养基成分对灭菌的影响油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。（2）培养基的物理状态对灭菌的影响（3）培养基中微生物数量对灭菌的影响（4）培养基中氢离子浓度对灭菌的影响培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低。第34页/共67页（5）微生物细胞中水分对灭菌的影响细胞含水越多，蛋白质变性的温度越低（6）微生物细胞菌龄对灭菌的影响老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高（7）空气排除情况对灭菌的影响（8）搅拌对灭菌的影响（9）泡沫对灭菌的影响第35页/共67页六、发酵罐的灭菌

培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或蛇管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。七、补料液的灭菌

在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属设备和管道都要经过灭菌。第36页/共67页4.5空气除菌4.5.1空气中微生物的分布和发酵工业对空气无菌程度的要求无菌空气的概念

通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。空气中微生物的分布一般设计时以含量为103~104个／m3进行计算。第37页/共67页提问引出新课请问你在实验室已接触过哪些“无菌空气”的例子？第38页/共67页发酵对空气无菌程度的要求酵母菌培养氨基酸液体曲抗生素一般按染菌机率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许1~2次染菌。第39页/共67页4.5.2空气除菌方法1、辐射灭菌α射线、X射线、β射线、γ射线、紫外线、超声波2、加热灭菌利用空压机所产生的热来进行灭菌第40页/共67页3、静电除菌对1μm的微粒去除率达99％，消耗能量小，每处理1000m3的空气每小时只耗电0.4~0.8kW。空气的压力损失小，一般仅(3~15)×133.3Pa。但对设备维护和安全技术措施要求较高。静电除尘器1-钢丝（电晕电极）；2-钢管（沉淀电极）；3-高压绝缘瓷瓶；4-钢板；5-空气出口；6-封头；7-钢板；8-法兰；9-空气出口第41页/共67页用静电除菌净化空气有如下优点：(1)阻力小，约1.01325×104Pa；(2)染菌率低，平均低于10~15％；(3)除水、除油的效果好；(4)耗电少。

缺点是设备庞大，需要采用高压电技术，且一次性投资较大；对发酵工业来说，—其捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。4、介质过滤常用的过滤介质：棉花、玻璃纤维、活性炭、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、烧结材料、新型过滤介质。第42页/共67页4.5.3空气过滤除菌（一）、空气过滤除菌流程第43页/共67页第44页/共67页1、高空采风、两次冷却、两次分油水、适当加热流程

特点：两次冷却、两次分油水、适当加热。空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却至20～25℃，经分水后加热到30～35℃，因为温度升高，相对湿度下降。第45页/共67页第46页/共67页

2、冷热空气直接混合式空气除菌流程

特点：省去一级冷却和分离设备及空气再加热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却器，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，使混合后的空气温度为30～35℃，相对湿度为50～60%。

第47页/共67页第48页/共67页其他几种空气除菌流程第49页/共67页高效前置过滤除菌流程

在压缩机前设置一台高效过滤器，这样便可降低过滤器负荷（即多次过滤），达到空气除菌的要求。

第50页/共67页第51页/共67页第