微生物基因组学专家讲座

一、概述1、微生物基因组学：是在微生物全基因测序基础上，对单个基因或多个基因作用、功效以及它们之间相互关系一门学科。2、微生物基因组学是人类基因组学一部分：1994年美国首先发起微生物基因组研究计划，称为MGP计划（microbialgenomicproject,MGP），它是人类基因组计划一个主要组成部分。微生物基因组学专家讲座第1页3、微生物基因组学主要研究内容⑴从研究工作内容而言①结构基因组学②功效基因组学③比较基因组学⑵从工作次序而言①微生物基因序列测定②微生物基因组注释③微生物基因组功效研究微生物基因组学专家讲座第2页二、微生物基因组序列测定㈠测序目标研究基因组前提和基础。㈡测序策略1.应依据待测序列长度、要求测序准确度和现有条件来制订测序策略。2.测序类型分为两类:①确认性测序②从头测序微生物基因组学专家讲座第3页大规模基因组测序几个支撑技术

Sanger双脱氧末端终止法

PCR技术1、克隆2、水生栖热菌(Thermusaquaticus)3、罗氏制药

DNA自动测序仪发展

AppliedBiosystems美国应用生物系统企业

生物信息学分析软硬件设施微生物基因组学专家讲座第4页DNA测序有几个方法，但到当前为止最惯用是20世纪70年代中期创造链终止（Sanger法）SangeristheonlychemisttohavereceivedtwoNobelPrizesinChemistry,thefirstasthesolerecipientin1958forhisworkoninsulin,andthesecondin1980,sharedwithPaulBergandWalterGilbert,forthesequencingofnucleicacids.

微生物基因组学专家讲座第5页“双脱氧末端终止”含义微生物基因组学专家讲座第6页Sanger双脱氧末端终止法测序原理微生物基因组学专家讲座第7页自动化测序

荧光染料标识物创造：使链终止法用于自动化测序，用不一样荧光色彩标识ddNTP，如ddATP标识红色荧光，ddCTP标识蓝色荧光，ddGTP标识黄色荧光，ddTTP标识绿色荧光。因为每种ddNTP带有各自特定荧光颜色，而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。微生物基因组学专家讲座第8页微生物基因组学专家讲座第9页微生物基因组学专家讲座第10页第一代测序技术：Sanger等创造双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等创造化学降解法。第二代测序技术——循环阵列合成测序法第三代测序技术（单分子测序，直接测序）近期出现Helicos企业Heliscope单分子测序仪、PacificBiosciences企业SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies企业正在研究纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。测序技术展望非光学显微镜成像：将核苷酸空间线性排列方式可视化。微生物基因组学专家讲座第11页美国X奖基金会年10月4日宣告设置一项金额高达1000万美元奖金，激励科学家“多快好省”地绘制出人类基因图谱。规则：在30天内以高准确度测序100个百岁老人基因组样本，并覆盖98%基因组，每个基因组测序费用控制在1000美元或以下。微生物基因组学专家讲座第12页㈢微生物基因组测序策略1.随机测序法即不考虑方向性，随机对靶DNA进行测序，最终采取计算机拼装而得到完整序列信息。该方法又包含两种方法。⑴鸟枪法它包含有三种消化法①限制性内切酶消化法②超声波处理法③胰DNA酶消化法微生物基因组学专家讲座第13页⑵人工转座子法转座子是含有跳跃功效DNA元件，是细菌或酵母染色体上特定基因区，利用转座酶可使转座子随机插入靶DNA。优点：①一次体外反应即可形成大量转座子插入。②能够在其上加入更有利于DNA测序（或制图）基因元件。③人工合成转座子两头带有特殊引物位点，所以插入位点两侧序列可有效快速地得以确定。微生物基因组学专家讲座第14页一段DNA次序能够从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后基因起调控作用，此过程称转座。转座子(transposons)在原核生物与真核生物基因组中存在着可从一个染色体位点转移到另一位点一些DNA序列。（文件上有时形象地称其为是跳跃基因，jumpinggene）。

微生物基因组学专家讲座第15页1951.BarbaraMcClintock提出转作和跳跃基因概念DNA1967年Shapiro才在E.coli中发觉了转座因子微生物基因组学专家讲座第16页微生物基因组学专家讲座第17页2.定向测序法是指特定地从目标片段某一端开始测序，直至把靶片段测完。定向测序法包含引物测序法和定向缺失测序法。⑴引物测序法即在第一次测序结果基础上，设计新寡核苷酸，来充当下一次测序反应引物，并依次类推，从而循序渐进取得靶DNA全部序列。微生物基因组学专家讲座第18页⑵定向缺失法定向缺失法是将一个靶DNA变成若干套嵌套缺失突变体，使靶序列中远不可测区段逐步落入可用通用引物进行测序方法。微生物基因组学专家讲座第19页微生物基因组学专家讲座第20页作图法测序与序列组装微生物基因组学专家讲座第21页

两种大规模基因组测序策略比较

项目

策略全基因组霰弹法逐步克隆法

遗传背景不需要需要（需构建准确物理图谱）速度快慢费用低高计算机性能高（以全基因组为单位进行拼接）低（以BAC为单位进行拼接）适用范围工作框架图精细图代表测序物种果蝇、水稻人、线虫微生物基因组学专家讲座第22页23当前惯用人造染色体载体细菌人工染色体载体（BAC）酵母人工染色体载体（YAC）黏粒载体（cosmid）P1人工染色体载体（PAC）微生物基因组学专家讲座第23页pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1YAC载体复制元件和标志基因YAC载体应含有以下元件：酵母染色体端粒序列酵母染色体复制子酵母染色体着丝粒序列酵母系统选择标识大肠杆菌复制子标识YAC载体装载量为250-400kb微生物基因组学专家讲座第24页酵母人工染色体（Yeastartificialchromosomes简称YAC），是一个能够克隆长达400KbDNA片段载体，含有酵母细胞中必需端粒、着丝点和复制起始序列。微生物基因组学专家讲座第25页细菌人工染色体（Bacterialartificialchromosome，BAC）是指一个以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成细菌染色体克隆载体，惯用来克隆150kb左右大小DNA片段，最多可保留300kb个碱基对。微生物基因组学专家讲座第26页（四）影响测序原因不论采取随机测序还是定向测序都可碰到以下影响原因。1.计算机设备。2.靶DNA性质。3.完成测序所需时间。4.采取测序策略。微生物基因组学专家讲座第27页三．微生物基因组注释（一）概念：在微生物基因测序基础上，对其基本结构和部件进行认定，以深入研究其功效。微生物基因组学专家讲座第28页（二）微生物基因组注释内容1.碱基组成份析，即G+CMol%测定。G+C含量是物种一个主要特征，在微生物分类上含有主要意义，是主要参数之一。2．开放阅读框判定：3．编码序列分析微生物基因组学专家讲座第29页4.tRNA基因检索：依据特异三叶草结构来判定，可采取专门分析软件。5.rRNA基因检索：利用现有已知16srRNA序列来判定基因组含rRNA基因。6.特殊序列检索7.复制原点判定（1）判定目标复制原点即微生物基因组1号碱基位置。（2）判定原理复制原点有其特殊结构。如E.coli复制原点为为一段245个bp序列，其中包含有四个核苷酸9聚体“TTATCCACT”。（3）判定方法可采取特殊分析软件。微生物基因组学专家讲座第30页微生物基因组学专家讲座第31页8.同源性基因检索（1）目标对每一未知基因均进行同源性搜索以确定其基因初步特征。（2）搜索原理依据其结构、排列同源性。（3）搜索方法采取美国BLAST软件。微生物基因组学专家讲座第32页四．微生物基因组图谱微生物基因组图谱主要包含两种，即遗传图谱和物理图谱。(一)遗传图谱1.概念是经过突变表型判定出来其基因组上一系列基因图，包含各个基因在基因组中排列次序和准确定位。微生物基因组学专家讲座第33页2.建立基因遗传图谱方法(1)中止杂交法即将两个菌株共同培养,并每隔一段时间中止培养,以判定其基因型,并以判定一些基因转化次序和位置。(2)噬菌体转导试验PI噬菌体是普遍性转导噬菌体。它可在供体菌DNA断裂时，误将DNA片段包装于本身而带入受体菌基因组中，并形成稳定转导子。也可将紧密联锁几个基因也转导过去（此为共转导）。微生物基因组学专家讲座第34页（二）物理图谱1．物理图谱概念：是在DNA分子上指出限制性内切酶限制性位点、数目及其限制性片段大小与排列次序图谱，又叫限制性图谱。2．构建微生物基因物理图谱意义（1）用于基因克隆；（2）用于序列分析；（3）用于southern杂交和RFLP多态性分析。3．构建物理图谱方法（1）限制性内切酶部分消化法（2）双酶消化法（3）内外切酶混合消化（4）分子杂交（5）Southern十字杂交法微生物基因组学专家讲座第35页五、微生物基因组功效分析1、依据目标基因组性状而推测可能基因组功效。如致病岛G+Cmol%与细菌本身G+Cmol%有很大差异。致病岛或耐药岛等。2、依据已知数据库进行同源性搜索。美国NIHGenBank；欧洲分子生物学试验数据库（FMBL）日本DNA数据库(DDBJ)3、利用不一样条件、不一样作用原因影响而判定未知基因功效。如用过氧化氢酶处理沙门氏菌而取得该菌对H2O2氧化应激反应基因。4、采取基因敲除方法来推测或确定基因功效。微生物基因组学专家讲座第36页六、研究基因组功效意义1．加速致病基因研究2．寻找灵敏而特异性病原分子标识病原微生物特异性DNA序列能够作为分子标识用于疾病诊疗。3．促进新药发觉和疫苗发展（1）促进新药发觉（2）疫苗研究4．促进微生物分类发展微生物基因组学专家讲座第37页5.提升对人类相关基因功效认识（1）一些人类遗传性疾病，如结肠癌、肝豆状核变性、肾上腺脑白质营养不良等，在细菌基因组分析中，也存在类似蛋白物。（2）能够利用微生物做模拟，去检测高等生物基因性状和功效。（3）从基因水平去揭露人类疾病与病原微生物之间关系，如发病机理，人类与病原微生物之间相互作用基因机理等。微生物基因组学专家讲座第38页七、微生物基因组功效学研究现实状况（一）微生物基因组序列测定1.病毒基因组序列测定2.原核细胞微生物序列测定1994年美国发起微生物基因组计划，实质上就是以细菌基因组计划为开始生物工程（不包含病毒）。3.真核细胞微生物序列测定1996年第一个完成酿酒酵母测序，至当前为止，已经有数种真菌测序完成，还有246中正在测序之中。微生物基因组学专家讲座第39页（二）微生物基因组测序碱基数1.病毒基因碱基数：最小病毒，如乙肝病毒，只有3kb碱基数，而最大痘病毒则有300kb碱基数。2.细菌基因组碱基数：细菌基因组碱基数一样差异很大，小至支原体为50万bp，大至黄色粘球菌为900万bp。3.真菌碱基数：当前测定微孢子虫为300万bp。4．人类碱基数为31.647亿bp。微生物基因组学专家讲座第40页（三）微生物基因组数1.病毒基因组数由数个至数百个。2.细菌基因组数由数百个至数千个。如百脉根中间根瘤菌为8000个基因组。3.真菌基因组数基本上同细菌。如酿酒酵母为6000个。附：人类基因组数为2-2.5万个，线虫2万个，果蝇1-1.5万个。微生物基因组学专家讲座第41页人类基因组计划

HGP(HumanGenomeProjects)凯克加州大学微生物基因组学专家讲座第42页年6月26人类基因组工作草图绘制成功。年3月果蝇。12月拟南芥基因组完整图谱。年:HGP和美国塞莱拉企业将各自测定人类基因组工作框架图分别发表在Nature和Science上。年，

12月

《Nature》小鼠基因组。在人类基因组计划中，包含对五种生物基因组研究：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠，称之为人类五种“模式生物”。微生物基因组学专家讲座第43页微生物基因组学专家讲座第44页,4以杨焕明在Science水稻全基因组框架序列图。基因总数：约为人类2倍；其中10000个基因功效已确定；水稻“垃圾”序列多位于基因外，人类“垃圾”序列多位于基因内；水稻基因平均4500bp,人类基因平均7bp。拟南芥约有25000个基因，80%在水稻中都存在，二者之间相关信号传导基因差异最大。微生物基因组学专家讲座第45页微生物基因组学专家讲座第46页微生物基因组学专家讲座第47页

中国家蚕基因组计划项目主持人、中国工程院院士向仲怀

中国家蚕基因组计划主要攻关教授，西南农业大学教授夏庆友正在做测试。微生物基因组学专家讲座第48页年人类表观基因组计划(HumanEpigenomeProject)于10月7日正式开启。这是世界上首项针对控制人类基因“开”和“关”主要化学改变进行图谱绘制工作，它将帮助科学家建立人类遗传与疾病之间关键联络。年10月国际人类基因组计划合作组织在《Nature发了杂志上宣告误差小于10万分之一人类基因组完成图已成功绘就。已将原来15万个“缺隙”降低到341个。完成图显示人类基因组只含有2～2.5万个基因。年8月

在（Nature）杂志发表了水稻基因组“精细图”，覆盖率达95.3％，中国对国际水稻基因组计划贡献率达20％，共定位了37,500个基因，还率先完成了对着丝粒测序。年9月1日出版《Nature》和9月2日出版《Science》杂志，黑猩猩和人类基因组ＤＮＡ序列相同性到达99％；即使考虑到ＤＮＡ序列插入或删除，二者相同性也有96％。封面文章。年10月28日

迄今最古老人类基因组测序完成，起源：《中国科学报》

线粒体微生物基因组学专家讲座第49页（四）微生物基因组结构和功效一些特点1.病毒基因组结构和功效特点（1）病毒小，结构简单，与细菌和真核细胞生物相比，其基因组很小，各种病毒间也差异很大，约相差1～2个数量级。（2）病毒基因组（3）多数RNA病毒基因组是连续，也有一部分RNA病毒基因组是不连续微生物基因组学专家讲座第50页（4）基因组重合现象病毒基因组重合现象是Sanger1977年研究E.coli噬菌体фх174时发觉。该噬菌体是单链DNA分子，有5375个核苷酸，可编码11种蛋白质，总分子量为25万左右，相当于6078个核苷酸编码产物。病毒基因组重合现象能够有两种情况：完全重合部分重合（5）病毒大部分基因编码蛋白质，只有一少部分基因不编码蛋白质，这种不编码蛋白质基因普通少于5﹪。如фх174噬菌体不编码核苷酸为217，占总基因数4.04﹪，（217/5375），这些不编码基因多数为基因表示调控基因。人类不编码蛋白基因为98﹪，只有2﹪是编码蛋白基因。微生物基因组学专家讲座第51页

莲人在绿杨津采一玉漱声歌新阙

采莲人在绿杨津，在绿杨津一阙新；一阙新歌声漱玉，歌声漱玉采莲人。微生物基因组学专家讲座第52页微生物基因组学专家讲座第53页（6）在病毒基因中，功效相当蛋白质基因或rRNA基因往往聚集在基因组一个或几个特定部位，形成一个功效单元或转录单元。它们能够一起转录成含有多个mRNA多顺反子，再剪接成单顺反子，再翻译成蛋白质，如腺病毒等。（7）除反转录病毒外，其它病毒均为单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。反转录病毒基因组则有2个拷贝。（8）噬菌体基因是连续，而真核细胞病毒基因组鲜有内含子。除正链RNA病毒外，真核细胞病毒都是转录成mRNA前体，再剪切加工，去掉内含子，形成成熟mRNA。（9）病毒适应性基因丢失微生物基因组学专家讲座第54页2.细菌基因组结构和功效一些特点（1）细菌染色体数目以前认为细菌染色体数只有一条，经基因组研究后，确定了细菌染色体数是1条以上。〈2〉细菌基因组结