基因诊断的基本原理与临床意义

第八

章基因诊疗GeneDiagnosis基因诊断的基本原理与临床意义第1页人类疾病原因内因：基因结构改变（基因突变）——点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增

基因结构多态性

基因表示异常外因：

病原体侵入基因诊断的基本原理与临床意义第2页对于疾病诊疗依据：临床表现试验室诊疗技术：细胞学检验生物化学代谢产物和酶活性改变检验免疫学检验

基因诊疗基因诊断的基本原理与临床意义第3页一、基因诊疗概述(一)基因诊疗概念与特点(二)基因诊疗基本原理与临床意义基因诊断的基本原理与临床意义第4页(一)基因诊疗概念与特点1．概念：指利用分子生物学技术，从DNA或RNA水平检测基因存在、分析基因结构变异和表示状态，对疾病作出诊疗方法和过程。基因诊疗以DNA和RNA为诊疗材料，

DNA诊疗RNA诊疗基因诊断的基本原理与临床意义第5页2．基因诊疗特点：（1）直接检测基因，属病因诊疗，针对性强；（2）特异性强、灵敏度高：因为基因诊疗采取核酸分子杂交、聚合酶链反应等技术；（3）适用范围广：其应用范围已从原先局限遗传性疾病扩大到感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等领域。基因诊断的基本原理与临床意义第6页基因诊疗评价特异性灵敏度重复性快速经济基因诊断的基本原理与临床意义第7页(二)基因诊疗基本原理与临床意义1．基本原理：

经过检测致病基因（包含内源基因与外源基因）存在、量多少，结构改变是否及表示水平是否正常，以确定被检验者是否存在基因水平异常改变，以此作为疾病确诊依据。2．临床意义:

对有表型出现疾病作出明确诊疗

早期快速诊疗

确定个体对疾病易感性疾病分期分型、疗效监测、预后判断等

基因诊断的基本原理与临床意义第8页二、基因诊疗惯用技术与方法(一)基因诊疗惯用技术(二)基因诊疗基本方法基因诊断的基本原理与临床意义第9页(一)基因诊疗惯用技术核酸分子杂交PCR（聚合酶链式反应）限制性酶切分析SSCP（单链构象多态性分析）DNA测序DNA芯片技术基因诊断的基本原理与临床意义第10页基因诊疗技术分类1、Molecularhybridization：

Southern,Northern,dotblot,2、PCR3、DNA测序4、DNA芯片技术基因诊断的基本原理与临床意义第11页1.核酸分子杂交

MolecularhybridizationSouthernblot——DNANorthernblot——RNADotblot，InSituHybridization,基因诊断的基本原理与临床意义第12页核酸杂交基本原理：利用核酸变性和复性理论：（1）双链DNA分子在一些理化原因作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（2）含有互补碱基序列异源核酸单链之间一样可按碱基互补配对标准经过氢键结合为双链。基因诊断的基本原理与临床意义第13页核酸分子杂交流程示意图待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参加杂交探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针标记加入标识核酸探针基因诊断的基本原理与临床意义第14页探针种类DNA

探针:基因组DNA探针;基因探针cDNA探针:当前应用最广泛寡核苷酸探针(Oligonucleotideprobes)RNA探针:基因诊断的基本原理与临床意义第15页

不一样探针在应用中有各自特点,但最主要是探针序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择。对致病性微生物应选取其最保守、最特异序列；对突变基因检测，应用含有突变位点序列或待测基因编码ｍＲＮＡ序列。基因诊断的基本原理与临床意义第16页探针标识物放射性标识物32P，35S，125I，3H非放射性标识物生物素，地高辛，荧光素，酶，金属基因诊断的基本原理与临床意义第17页SouthernblotNNTTNTT基因诊断的基本原理与临床意义第18页1、Southernblot：用于DNA检测，不但能检测出特异DNA片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。2、Northernblot：杂交用于RNA检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。3、dotblot：既可检测DNA也或检测RNA，用于基因组中特定基因及其表示定性和定量分析。缺点：特异性较低，不能判定所分析基因分子量。4、原位杂交：在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析，并可定位。基因诊断的基本原理与临床意义第19页PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化反应重复进行同一段DNA片段合成过程（二）PCR技术是基因诊疗一个基础技术基因诊断的基本原理与临床意义第20页PCR技术优点特异性强灵敏度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率基因扩增技术基因诊断的基本原理与临床意义第21页1、直接采取PCR技术进行基因诊疗

经过PCR技术扩增特异性基因，能够确定病原生物基因是否存在或分析疾病相关体内基因缺失或基因突变

基因诊断的基本原理与临床意义第22页2、采取PCR产物限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP）基因突变造成基因碱基组成和次序发生改变，会在基因结构中产生新限制性内切酶位点或使原有限制性内切酶位点消失。所以，突变基因经对应限制性内切酶水解后，其电泳条带数量和大小就会发生改变，依据这些改变能够判断突变是否存在。即限制性片段长度多态性技术。

PCR－RFLP就是利用PCR技术先将包含待测位点DNA片段扩增出来，然后用识别该位点限制性内切酶水解，依据限制性片段数量和长度作出诊疗。基因诊断的基本原理与临床意义第23页3、采取PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术等位基因特异性寡核苷酸探针技术（ASO）原理：针对已知突变位点基因，能够分别针对已知突变位点序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与突变序列互补。同时设计探针时，突变碱基应位于探针中央，这么在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全互补探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基与靶序列不匹配探针则被洗脱。基因诊断的基本原理与临床意义第24页

PCR/ASO则是采取PCR扩增受检者基因目标片段，并与对应ASO探针杂交，假如受检者DNA扩增产物与正常探针杂交，而不与突变探针杂交，表示受检者不存在突变基因；假如只有突变探针能够杂交，说明突变基因为纯合子；假如二者都存在，则说明突变基因为杂合子。采取PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术基因诊断的基本原理与临床意义第25页

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常探针

突变探针基因诊断的基本原理与临床意义第26页4、PCR产物反相点杂交分析技术

此项技术与PCR/ASO技术原理完全相同，只是杂交时采取是反相杂交。是将探针固定在膜上成为固定相，用PCR产物作为液体相，进行杂交试验。基因诊断的基本原理与临床意义第27页

单链构象多态性（SSCP）分析是一个基于单链DNA构象差异来检测点突变方法。DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间相互作用，形成一定立体构象。相同长度单链DNA会因分子内碱基组成或排列次序不一样，形成构象就不一样，这么就形成了单链构象多态性。对长度相同而构象不一样单链DNA在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现出不一样迁移率。

5、采取PCR产物单链构象多态性分析进行基因诊疗基因诊断的基本原理与临床意义第28页

PCR-SSCP技术就是利用PCR扩增目标基因片段，经过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸改变会造成DNA片段构象改变，其迁移率也会改变，从而检测基因突变。基因诊断的基本原理与临床意义第29页基因诊断的基本原理与临床意义第30页

该技术是先制备浓度从低到高变性剂凝胶，然后将待测分析PCR扩增产物进行电泳，到DNA电泳到变性剂浓度能使DNA发生变性位置时，DNA双链分开，因为不一样DNA片段碱基组成不一样，所以在凝胶中泳动发生变性位置不一样，迁移率也不一样，所以能够将相同长度但碱基组成不一样DNA片段分开，从而能检测出基因突变。6、采取PCR结合变性梯度凝胶电泳技术基因诊断的基本原理与临床意义第31页

DNA甲基化是表观遗传学主要组成部分，在维持正常细胞功效、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着主要作用，是当前新研究热点之一。如在普通正常细胞中，基因调控区CPG岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往展现甲基化状态。所以DNA甲基化研究是一热点。7、甲基化特异性PCR技术基因诊断的基本原理与临床意义第32页

将DNA先用亚硫酸盐处理，这么未甲基化胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化不变，随即行引物特异性PCR。在MS-PCR中设计两对引物，一对为甲基化特异性引物（primerⅠ），一对为非甲基化引物（primerⅡ），进行特异性扩增，只有结合完全甲基化或非甲基化特异性引物片段才能扩增出产物，最终能够确定研究DNA片段部位甲基化情况。甲基化特异性PCR技术（MS-PCR）基因诊断的基本原理与临床意义第33页基因诊断的基本原理与临床意义第34页以上介绍基于PCR扩增技术建立基因诊疗技术，只能提供定性结果，即有没有突变。但对基因表示异常疾病，上述方法无法满足需要，还需要研究其基因表示量上改变分析，故还可利用PCR定量分析基因表示。PCR定量分析方法有：梯度（系列）稀释法、极限稀释法、非竞争性对照法、竞争抑制法、

荧光定量PCR8、采取PCR技术进行靶核酸定量分析基因诊断的基本原理与临床意义第35页PCR扩增有限性-平台期及平台效应（plateaueffect）

PCR扩增平台效应基因诊断的基本原理与临床意义第36页梯度（系列）稀释法：在扩增检测待测样本同时，扩增一系列稀释已知标准（通常为质粒DNA）假如在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增待测样本中PCR模板相对量.必须在扩增指数期进行优点：简单，可作粗糙定量分析。缺点：不准确，影响原因多。

基因诊断的基本原理与临床意义第37页首先将原始模板进行梯度稀释;然后对该稀释系列进行PCR扩增测定;最低阳性样本被认为含有与一已知标准稀释系列中最终阳性样本中相同量PCR模板基本依据：PCR扩增有效起始模板分子数为104～106个改良方法：极限稀释分析基因诊断的基本原理与临床意义第38页基因诊断的基本原理与临床意义第39页非竞争性对照基因定量法该定量法是靶基因与参考基因同时扩增。即在一样反应条件下，在一个试管内同时扩增来自同一DNA一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们mRNA)。经过比较两种序列扩增产物电泳带颜色强度对靶基因定量。基因诊断的基本原理与临床意义第40页竞争PCR与前述方法相同，即靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参考标准通常是一段人工合成模板而不是内源性基因。竞争PCR必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，含有相同引物结合位点，其扩增产物能经过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。将竞争模板作系列稀释后，加入到恒量样品DNA进行PCR，经过分离和分析竞争模板与样品DNA产量，对样品DNA进行定量分析。竞争性PCR：基因诊断的基本原理与临床意义第41页3.DNA

sequencingDNA序列测定是最直接、最准确基因诊疗技术基因诊断的基本原理与临床意义第42页例：四色荧光自动测序分析结果基因诊断的基本原理与临床意义第43页基因诊断的基本原理与临床意义第44页4.DNA芯片技术

DNAchipsormicroarray基因诊断的基本原理与临床意义第45页

指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印方式有序地固化于支持物表面，然后与标识样品杂交，经过对杂交检测分析，得出样品遗传信息（基因序列及表示信息）

因为在制备过程中利用了计算机芯片制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且惯用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术DNA芯片技术概念基因诊断的基本原理与临床意义第46页DNA芯片技术原理大规模集成固相杂交基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性原理

以大量已知序列寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后经过定性、定量分析得出待测样品基因序列及表示信息基因诊断的基本原理与临床意义第47页第二节对不一样疾病采取不一样基因诊疗策略

人类疾病各种多样，致病原因不一样，所以在基因诊疗上也有不一样路径和策略。1、对致病基因已经找到、发生机制清楚疾病，能够经过直接检测致病基因进行基因诊疗。如：病原微生物感染：病毒、细菌、寄生虫、真菌等，及与疾病相关机体内源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。

基因诊断的基本原理与临床意义第48页2、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组特定区域疾病，能够经过检测致病基因联锁遗传标识进行基因诊疗。

如：用限制性内切酶位点作为遗传标识，利用该遗传标识与相邻基因在遗传过程中分离几率很低，经常一起遗传，形成连锁特点，建立了染色体基因连锁图，依据基因连锁图，经过分析连锁基因遗传标识，可判断致病基因存在可能性。第二节对不一样疾病采取不一样基因诊疗策略基因诊断的基本原理与临床意义第49页3、对多原因、多基因疾病，能够经过检测表型克隆基因进行基因诊疗。第二节对不一样疾病采取不一样基因诊疗策略如高血压、冠心病、肿瘤、精神病、本身免疫性疾病，因为疾病发生原因复杂，包括多基因、多原因。所以可采取表型克隆方法来分析诊疗。原理：从分析正常和异常基因组采取差异显示等技术找到正常人和疾病患者之间差异序列，进行克隆。依据克隆一组基因差异序列制作对应探针，用制备这一组探针检测相关疾病方法。基因诊断的基本原理与临床意义第50页第二节对不一样疾病采取不一样基因诊疗策略4、对一些因基因表示异常出现疾病，可经过基因表示定量分析进行基因诊疗。对与基因表示异常出现疾病，能够在转录水平上对该基因表示mRNA量进行分析，作出诊疗。基因诊断的基本原理与临床意义第51页第三节基因诊疗应用前景1.杂交基础上RFLP分析（20世纪80年代）2.PCR及其衍生技术3.基因芯片技术基因诊疗发展历史基因诊断的基本原理与临床意义第52页第三节基因诊疗应用前景1.理论2.技术3.伦理基因诊疗过程中存在问题基因诊断的基本原理与临床意义第53页

遗传病基因诊疗是在基因水平上对核酸碱基序列突变检测，从遗传物质分子水平上揭示疾病发生原因和分子机制。遗传病诊疗分为产前检验、症状前诊疗和症状后诊疗。遗传病基因诊疗是进行产前检验和症状前诊疗唯一选择，也是遗传病预防最为有效伎俩。第四节、基因诊疗技术检测遗传病基因诊断的基本原理与临床意义第54页基因诊疗技术路径：①直接分析致病基因分子结构及表示是否异常直接诊疗路径；②利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析间接诊疗路径。第四节遗传病基因诊疗基因诊断的基本原理与临床意义第55页第四节遗传病基因诊疗直接诊疗：检测已知致病基因

必要条件①被检基因突变类型与疾病发病有直接因果关系：②被检基因正常分子结构已被确定；③被检基因突变位点固定而且已知。基因诊断的基本原理与临床意义第56页

1.点突变：（1）造成特异性限制性内切酶位点改变

直接诊疗：检测已知致病基因基因诊断的基本原理与临床意义第57页血红蛋白病能够由血红蛋白结构或合成异常所致遗传性疾病。前者称为异常血红蛋白病，后者称为地中海贫血。针对异常血红蛋白病如镰刀状红细胞贫血症是因为珠蛋白基因第6位密码子GAG突变成GTG，造成蛋白结构异常。对此遗传病基因诊疗可采取PCR-限制性内切酶分析技术。镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变：基因诊断的基本原理与临床意义第58页×5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析PCR-RE分析MstIICCTGAGG-CCTGTGG基因诊断的基本原理与临床意义第59页+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析基因诊断的基本原理与临床意义第60页1.点突变：（2）无限制性酶切位点改变

直接诊疗：检测已知致病基因

PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交等技术。PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。

基因诊断的基本原理与临床意义第61页Β地中海性贫血基因诊疗（PCR-ASO）已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，32P标识，进行SouthernBlot杂交/斑点杂交。

NormalβΑGeneProbe——与正常βΑ杂交MutationβSGeneProbe——与异常βS杂交基因诊断的基本原理与临床意义第62页

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常探针

突变探针基因诊断的基本原理与临床意义第63页1、Gene缺失遗传病诊疗1）α地贫Gene诊疗α基因不一样程度缺失引发不一样类型α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb片段，而缺失一个αGene时可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe基因诊断的基本原理与临床意义第64页以αGene为探针，Southernblot方法检测αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb基因诊断的基本原理与临床意义第65页直接诊疗：检测已知致病基因

在DNA序列上有较长一段序列重新排布。包含大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引发更大范围内染色体结构上改变从而影响多个基因功效，即染色体突变或畸变，包含染色体易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等2.基因重排\缺失：核酸分子探针杂交与PCR基因诊断的基本原理与临床意义第66页

（1）Southern印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，经过设计一系列对应于缺失区域核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号（2）多重PCR，1988年Chamberlain等采取多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因多个基因座

直接诊疗：检测已知致病基因基因诊断的基本原理与临床意义第67页杜氏肌营养不良症基因诊疗DMD是一个严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79个Exon，cDNA全长13974bp，编码3685Aa，分子量427kD。DMD最主要遗传缺点是外显子缺失，约占60%~70%。基因诊断的基本原理与临床意义第68页1.DNAMarker2.阳性对照3.孕妇

1.DNAMarker2.阳性对照3.孕妇4.胎儿

5.阴性对照

4.胎儿

5.阴性对照采取多重PCR法扩增该基因多个外显子基因诊断的基本原理与临床意义第69页3.基因表示异常mRNA相对定量分析mRNA长度分析直接诊疗：检测已知致病基因基因诊断的基本原理与临床意义第70页二、遗传病间接诊疗当致病基因即使已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身还未知时，主要经过Gene和遗传标识连锁分析间接地作出诊疗。连锁分析基于遗传标识与Gene在染色体上连锁，经过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代取得某种遗传标识与疾病关系，间接推断受检子代是否取得带有致病基因染色体，间接地判断并做出诊疗。遗传标识（限制性片段长度多态性、微卫星DNA序列、单核苷酸多态性等）基因诊断的基本原理与临床意义第71页1Southernblot--RFLP诊疗(PKU)

PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系组员外周血DNA杂交。间接基因诊疗基因诊断的基本原理与临床意义第72页患者为19kb片段纯合子,说明患者缺点PAH基因与19kb片段连锁其父、母亲缺点PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁。II2为23kb和19kb片段杂合子，为表型正常致病基因携带者。间接基因诊疗基因诊断的基本原理与临床意义第73页成年型多囊肾病基因诊疗例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终造成肾功效衰竭和尿毒症。APKD——Gene定位16p13.3，但致病基因还未克隆，基因产物生化性质和疾病发病机理也还未说明，但已证实APKDGene与α珠蛋白基因3`端附近一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，所以，能够经过RFLP连锁分析进行诊疗。基因诊断的基本原理与临床意义第74页以3`HVR为探针，与PvuII酶切后家系相关组员基因组DNA进行SouthernBlot

基因组DNAPvuII酶切DNA片段变性转膜探针变性杂交结果分析间接基因诊疗基因诊断的基本原理与临床意义第75页结果1212345

5．7kb3．4kb2．3kb

基因诊断的基本原理与临床意义第76页结果分析

患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊疗正常.基因诊断的基本原理与临床意义第77页遗传疾病基因诊疗方法基因异常方法探针、引物或限制酶基因组DNA印迹杂交缺失基因探针基因缺失PCR扩增引物包含缺失或在缺失部位内

RFLP分析突变造成其切点消失限制酶点突变ASO杂交正常和异常ASO探针PCR产物多态性分析（SSCP）引引物包含突变部位基因未知与疾病连锁多态性分析与疾病连锁多态位点探针或引物基因诊断的基本原理与临床意义第78页肿瘤基因诊疗肿瘤发生包括多个基因、各种原因；发生过程呈多阶段性，其发生发展机制十分复杂，同时不一样肿瘤发生机制也不相同，所以在肿瘤基因诊疗时，无法采取统一策略。基因诊断的基本原理与临床意义第79页策略一、经过检测肿瘤染色体异位及融合基因诊疗淋巴造血系统肿瘤中,染色体异位和重排发生较为普遍.临床上出现炎症性淋巴结肿大与淋巴瘤肿大判定:在淋巴瘤细胞中，T细胞受体（TCR）基因和IgH基因发生重排，原来相隔数百个碱基IgH基因和TCR基因V区和J区基因就会靠近在一起，而炎症增生性细胞内就不会发生基因重排，故经过PCR扩增能够判定之。基因诊断的基本原理与临床意义第80页策略二、经过检测癌基因和抑癌基因诊疗肿瘤癌基因激活及抑癌基因失活与肿瘤发生发展关系亲密。多数肿瘤组织或肿瘤细胞中都检测到癌基因与抑癌基因突变。用基因诊疗方法：定量PCR、印迹技术、PCR-SSCP等检测。如ras癌基因，其激活分子机制主要是点突变，所以可经过PCR-ASO、PCR-SSCP等方法。

P53基因是抑癌基因，在肿瘤组织中其常发生突变而失活。所以可经过PCR-SSCP、DNA测序分析等，可检测P53基因突变。基因诊断的基本原理与临床意义第81页策略三、经过检测肿瘤相关病毒诊疗肿瘤鼻咽癌Burkitt淋巴瘤肝癌宫颈癌EB病毒HBV、HCV人类乳头瘤病毒HPV基因诊断的基本原理与临床意义第82页策略四、检测肿瘤标识物