第十一章文库的构建和目的基因的筛选详解演示文稿

第十一章文库的构建和目的基因的筛选详解演示文稿当前1页，总共107页。优选第十一章文库的构建和目的基因的筛选当前2页，总共107页。本章要求掌握基因组文库、cDNA文库的概念及构建方法；DNA文库的筛选方法（包括表型筛选法、PCR筛选法、酵母双杂交系统）及原理；熟悉基因组文库质量检测方法；DNA文库的分类；DNA文库的保存方法；了解各种类型cDNA文库（全长cDNA文库、差减cDNA文库等）的构建原理；外源DNA转移进宿主细胞的主要方法。当前3页，总共107页。基因库(genepool)：特定生物体全基因组的集合(天然存在)

。基因文库(genelibrary)：指某一生物体全部或部分基因的集合

。某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。根据外源DNA片段来源的不同，基因文库分为：基因组文库：材料来自染色体DNA，含有全部基因组序列。任何器官、组织、细胞、任何发育时期以及在任何环境下，基因组DNA是衡定的，所以用该生物的任何材料均可构建基因组DNA文库且具有一致性。定义和分类当前4页，总共107页。基因组文库：分离特定的基因、分析特定基因的结构、研究基因的起源与进化、基因的表达调控cDNA文库：大规模基因测序、发现和寻找新基因、基因注释、基因表达谱分析、基因功能研究cDNA文库：材料来自mRNA，含有全部蛋白编码基因的cDNA，无启动子、终止子、内含子、基因间隔区等，序列信息量远小于基因组文库。在高度分化的生物体中，不同器官、组织、细胞、不同发育时期以及对不同环境的应答中，mRNA种类和丰度不同，即表达谱不同，因此同种生物体的cDNA文库随表达谱变化而变化，用什么材料构建什么样的cDNA文库依研究目标而定。当前5页，总共107页。DNA文库构建的基本程序1、提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；2、DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；3、重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。当前6页，总共107页。第一节

基因组DNA文库的构建定义：指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。当前7页，总共107页。根据构建文库载体的不同，分为：1、质粒文库：容纳片段小于10kb，以菌落的形式保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。2、噬菌体文库：一般用λ载体，插入型容纳片段小于7kb，适合于构建cDNA文库，置换型容纳9-25kb，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。3、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比λ文库略长，达45kb左右。4、人工染色体文库：有细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1人工染色体(PAC)等文库，最大插入片段分别为300kb、1000kb和300kb，是大片段文库，主要用于基因组测序和物理图谱构建。5、亚基因组文库：相对于基因组文库提出的，文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段。亚基因组文库主要应用在基因组较小的物种基因克隆或大基因组物种的后期研究。当前8页，总共107页。文库的代表性和随机性代表性是指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。采用两个策略提高代表性：一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等；二是提高文库所含基因组DNA的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。文库的总容量由外源片段的平均长度和重组克隆的数量共同决定。当前9页，总共107页。为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数

p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率

f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值当前10页，总共107页。哺乳动物：3*109bp若p=99%，平均克隆片段长度20kbf=20kb/3*107kbN=690773.2E.Coli：4639221bpp=99%，f=20kb/4600kbN=1056.9p=99%，f=10kb/4600kbN=2116当前11页，总共107页。随机性既表示构建文库时要从基因组DNA获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。除了代表性和随机性外，一个理想的基因文库还应具备下列条件：

1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；

2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆

3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色体步查；

4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆；

5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。当前12页，总共107页。载体的选择构建大片段基因组DNA文库使用的载体主要有λ噬菌体（λphage）、粘粒载体（cosmid）、细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosomes,BAC）、酵母人工染色体YAC（YeastArtificialChromosomes,YACs）、P1（BacteriophageP1）和PAC。根据特征，这些载体可以分为两类:一类是基于噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点；

另一类经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源片段。当前13页，总共107页。基因组DNA文库的构建流程

基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：①载体的制备；②高纯度大分子量基因组DNA（HighMolecularWeightDNA,HMWDNA）的提取；③HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGEsizeselection）；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取和保存。当前14页，总共107页。当前15页，总共107页。1、基因组DNA文库的载体制备载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。

2、高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切

构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3～5倍。实践表明，提取的基因组DNA分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。当前16页，总共107页。培养的单细胞

组织

血液 收集单细胞

破碎

浓缩白细胞

清洗悬浮细胞⑴ 调整细胞浓度至确定值⑵低熔点琼脂糖凝胶固定成块状或粒状⑷蛋白酶K或脂酶在EDTA环境下消化蛋白质和脂质⑸清洗样品，保存在EDTA溶液 存在细胞壁时需降解处理⑶ 当前17页，总共107页。3、文库的连接转化或包装侵染

一般在构建大片段基因组DNA文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。4、文库的质量检测

文库的质量是由文库所含克隆的数目、平均插入片段的长度、插入效率、基因组覆盖度和覆盖倍数等因素所决定的。在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其它值都是估算的。当前18页，总共107页。基因组覆盖倍数的计算方法一般包括两种：一是公式计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是约数）；另一种算法是结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛选到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值。当前19页，总共107页。基因组DNA文库克隆子的保存1、影印滤膜保存法当前20页，总共107页。2、文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。3、保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大当前21页，总共107页。现在一般用文库阵列法（libraryarraying）保存大片段DNA文库，即利用聚乙烯材料制作的384孔（16×24）或96孔（8×12）无菌培养板来保存文库克隆。用手工或机器人将重组克隆挑至含抗冻液和抗生素的液体培养基的384孔或96孔板过夜培养。待培养液浑浊后，用384针或96针复制器制备多个拷贝，按编号保存于-80℃超低温冰箱。由于文库反复冻融会影响细菌的活性，一般文库的原始拷贝留在超低温冰箱内不让其发生冻融，只取一个拷贝用于后续的操作，该拷贝使用一段时间以后淘汰，重新以上一拷贝为模板制作新的拷贝使用，这样可将文库保存很长时间，可供长期反复使用。对大肠杆菌而言，使用添加抗冻液的培养基可延长文库使用时间。当前22页，总共107页。当前23页，总共107页。第二节

cDNA文库的构建cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。定义：是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。当前24页，总共107页。特征和应用：从cDNA文库分离基因比从基因组文库中分离基因更具优势。cDNA文库具有时空特异性，cDNA文库反映了特定组织（或器官）在某种特定环境条件下基因的表达谱。cDNA文库可用于大规模基因测序、发现和寻找新基因、基因注释、基因表达谱分析和基因功能研究等方面。当前25页，总共107页。cDNA文库的构建共分四步：①细胞总RNA的提取和mRNA分离；②第一链cDNA合成；③第二链cDNA合成；④双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。当前26页，总共107页。当前27页，总共107页。RNA的分离cDNA文库构建是以mRNA为起始材料的，mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。目前纯化mRNA的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]链，由它与mRNA的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。当前28页，总共107页。1、mRNA的来源:选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量。2、mRNA完整性的检测1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNAkb之间.2)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力。3)指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力。当前29页，总共107页。3、mRNA在细胞中的丰度1)高丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%,如珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，每个细胞大约5000拷贝，该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA；2)中等丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的10%左右，每个细胞大约200-300拷贝；2)低丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下，每个细胞大约1-15拷贝。当前30页，总共107页。4、mRNA的富集方法典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝。当前31页，总共107页。1)按大小对mRNA进行分级分离通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回收的得率较低.蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.2)cDNA的分级分离mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA分子分离开来。优点：a）避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解b）增加了获得全长cDNA克隆的概率c）获得更准确的分级分离效果（分子量）当前32页，总共107页。3）多聚核糖体免疫学纯化法使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体。将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，随后用EDTA将多聚核糖体解离下来，并通过Oligo(dT)层析分离mRNA,利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍。目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝。当前33页，总共107页。当前34页，总共107页。第一链cDNA的合成oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。缺陷：cDNA末端存在较长的poly（A）而影响cDNA测序；因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’－末端。对于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻烦。当前35页，总共107页。mRNA当前36页，总共107页。随机引物引导的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)：

根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。

随机引物cDNA合成的方法不适合构建cDNA文库，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。当前37页，总共107页。第二链cDNA的合成cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链的合成的方法主要4种：自身引导合成法、置换合成法、引导合成法、引物－衔接头合成法。当前38页，总共107页。1）自身引导合成法：获得的单链cDNA3’端具有形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。再利用S1核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA5’端的地方的序列出现缺失和重排。S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA分子。当前39页，总共107页。当前40页，总共107页。2）置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。当前41页，总共107页。优点：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化

c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA当前42页，总共107页。3）引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列首先是制备带有Poly（dT）的载体片段Ⅰ和一端带有Poly（dG）的片段Ⅱ，并用片段Ⅰ来代替Oligo（dT）进行cDNA第一链的合成，在第一链cDNA合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段Ⅱ一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在RNA酶H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链cDNA。主要特点：合成全长cDNA的比例较高，但操作比较复杂，形成的cDNA克隆中都带有一段Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利。当前43页，总共107页。当前44页，总共107页。4）引物-衔接头法：引导合成法改进而来第一链合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段带接头序列的Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的cDNA链，接头序列可以是适用于PCR扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列。这一方法目前已经发展成PCR法构建cDNA文库的常用方法。

当前45页，总共107页。当前46页，总共107页。双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖cDNA末端的处理由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部当前47页，总共107页。当前48页，总共107页。双链cDNA的克隆：

双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：1>平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收2>平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段3>加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收当前49页，总共107页。当前50页，总共107页。当前51页，总共107页。cDNA文库构建的其它类型1、均一化cDNA文库它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。当前52页，总共107页。现在，在构建均一化的cDNA文库中至少有2种主要的观点：一种是基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过cDNA与基因组DNA饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度；（基因组DNA饱和杂交法

）另一种是基于复性动力学的原理，高丰度的cDNA在退火条件下复性的速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度。（基于复性动力学原理的均一化方法）当前53页，总共107页。基因组DNA饱和杂交法

优点：简单，没有仪器上的限制。缺点：1、很难获得覆盖基因组的单链DNA片段，导致文库内基因的丢失，构建两个独立、互补的均一化文库可以一定程度地弥补这一不足；2、文库自身杂交的速度很快，导致基因丢失，但可将cDNA文库制备成单链后再与固定的基因组DNA杂交来克服。当前54页，总共107页。基于复性动力学原理的均一化方法优点：1、几乎不会导致起始文库中cDNA的丢失；2、均一化效果更为明显。缺点：控制参数较多，难以把握，需要多次尝试与摸索。当前55页，总共107页。均一化cDNA文库具有以下4方面的优点：第一，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本。第二，增加克隆低丰度mRNA的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三，与原始丰度的mRNA拷贝数相对应的cDNA探针与均一化的cDNA文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。而以往的文库构建，忽略了mRNA丰度的影响。第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。当前56页，总共107页。2、差减cDNA文库(SubtractivecDNAlibrary)差减文库也称扣除文库，扣除杂交法的本质是除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。扣除杂交技术（subtractivehybridization）是将含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为待测样本（tester），将基因表达谱相似或相近但不含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为对照样本（driver），将tester和driver的cDNA进行多次杂交，去掉在二者之间都表达的基因，而保留两者之间差异表达的基因，使低丰度基因在文库中的比例大大提高，筛选到差异表达的基因的可能性也大大提高。方法：抑制性扣除杂交、mRNA-cDNA杂交当前57页，总共107页。抑制性扣除杂交基本原理：SSH技术利用抑制性PCR能选择性扩增不同丰度差异基因和cDNA消减杂交特点,运用杂交二级动力学原理（即高丰度序列退火时产生同源杂交的速度大于低丰度序列）,使原本不同丰度的DNA序列相对含量趋于一致。然后利用抑制性PCR特点,两端接上同一接头的非目的基因片段由于具有反向重复序列,在退火时容易形成发夹互补结构,在PCR中不能作为模板与引物配对扩增,从而选择性扩增目的基因而抑制非目的基因片段扩增。消减杂交扣除了实验组和对照组之间同源序列,再结合抑制性PCR的动力学富集,实现高效分离低丰度特异性非同源片段。当前58页，总共107页。当前59页，总共107页。mRNA-cDNA杂交方法原理：用过量的驱动mRNA与供体的cDNA文库质粒反复多轮杂交，去除驱动和供体共同表达的基因，构建均一化的、扣除杂交cDNA文库。当前60页，总共107页。3、全长cDNA文库构建全长cDNA文库，不仅要考虑如何确保第二链的完整合成，还要考虑如何避开反转录酶或mRNA本身的影响。理论上讲，如果有一种方法能够在合成cDNA之后，对全长cDNA进行选择，就可大幅度提高全长cDNA克隆的比例。3个代表性的例子：SMART全长cDNA文库、Cap-Trapper法、烟草酸焦磷酸酶法当前61页，总共107页。SMART全长cDNA文库的构建方法：在第一链cDNA合成时，由于反转录酶带有末端转移酶的活性，当其到达mRNA5′端时会自动在第一链cDNA的3′末端加上几个d（C）。加入带有3个d（G）的特异性引物，该引物会与全长cDNA第一链互补结合，，然后继续以该引物为模板合成互补链。当前62页，总共107页。Cap-Trapper法构建全长cDNA文库：首先利用3′带锚定碱基的oligo（dT）12引物引导合成第一链cDNA。合成第一链cDNA时用dm5CTP代替dCTP，使所有的胞嘧啶都被5-甲基-dCTP取代，以保护cDNA不被随后的限制性内切酶消化。其次在mRNA的5′和3′末端标记上生物素，并用RNaseⅠ消化单链RNA。然后利用偶联了生物素抗体的磁珠分离出生长的cDNA-mRNA杂合双链，水解mRNA链后再利用加尾法在第一链cDNA末端加上oligo（dG），并合成第二链cDNA。最后用合适的限制性内切酶消化双链cDNA，与载体连接，包装后感染大肠杆菌即可获得全长的cDNA文库当前63页，总共107页。当前64页，总共107页。烟草酸焦磷酸酶法构建全长cDNA文库:烟草酸焦磷酸酶（tobaccoacidpyrophosphatase,TAP）法能特异地识别真核生物mRNA的5′端帽子结构并将其去除，暴露出切口5′端的磷酸基团，可以在该切口处连接一段特异的接头来引导cDNA第二链的合成。当前65页，总共107页。当前66页，总共107页。基因组DNA文库与cDNA文库的比较当前67页，总共107页。第三节基因克隆的筛选策略表型筛选法杂交筛选和PCR筛选免疫筛选酵母双杂交系统筛选当前68页，总共107页。表型筛选法表型筛选法是根据目的基因编码比较特殊的功能，并且其与载体作用可以在宿主菌（如大肠杆菌）中表达该基因，表现出其特殊的功能所决定的表型性状来，这样就很容易通过导入的基因带来新的功能或恢复其缺失的功能来确定目的基因。表型特征一般要求是直接的形态学特征或比较容易检测的生化酶学的特征，比如营养缺陷型相关的基因和抗性基因（类似抗逆性基因）等。对于表型筛选法来说，其对所使用的宿主有相应的要求，宿主为不携带该种基因或是该基因的缺失突变体。当前69页，总共107页。(1)抗药性筛选:这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。当前70页，总共107页。(2)插入失活筛选法经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子，也含有不需要的非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。当前71页，总共107页。(3)显色反应选择法(α-互补法)将含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为α-互补。当前72页，总共107页。当前73页，总共107页。杂交筛选和PCR筛选当目标基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表达的真核生物的基因，可以利用的可能只是该基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白质产物，此时就必须考虑其它的方法来筛选。杂交筛选法是应用最为广泛的筛选目标基因克隆的一种方法。用已知序列的基因的筛选保存于384孔培养板的大片段DNA文库时，还可以采用更加简单快捷的方法——混合池PCR筛选法。当前74页，总共107页。列混合池行混合池123456789101112131415161718192021222324ABCDEFGHIJKLMNOP当前75页，总共107页。免疫筛选免疫筛选法和核酸杂交的方法类似，只是其使用的探针不是核酸，而是特异性的抗体。适合免疫杂交法筛选的外源基因首先要在宿主细胞中存在抗原蛋白的表达，用于筛选的DNA文库必须是表达文库，通常是原核生物的基因组DNA文库和真核生物的cDNA表达文库。而且，所检测的对象为宿主中不编码的基因或宿主中缺失表达的基因。根据检测方法的不同，可以分为原位检测和免疫沉淀检测当前76页，总共107页。滤膜（固定抗原）+当前77页，总共107页。免疫沉淀检测法菌落沉淀素当前78页，总共107页。酵母双杂交系统筛选酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。用来筛选与已知基因的产物发生相互作用的蛋白的编码基因。典型的真核生物转录激活因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。当前79页，总共107页。当前80页，总共107页。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。单独的DB能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。当前81页，总共107页。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reportergene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞。酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。当前82页，总共107页。原理：在以上研究的基础上，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ等，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。当前83页，总共107页。当前84页，总共107页。酵母双杂交系统的优点⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。当前85页，总共107页。酵母双杂交系统局限性和存在的问题⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究；⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。当前86页，总共107页。克隆基因的验证和分析

酶切指纹图谱主要用于鉴定一些已知酶切位点基因的目的克隆，由于酶切的指纹图谱已知，当采用某种酶来消化待鉴定的克隆时，真阳性克隆会在电泳之后出现预期的指纹图谱。Southern杂交可真实的判断重组子中含有与探针DNA杂交的片段。二次杂交法主要用于核酸杂交法或PCR方法筛选的阳性克隆的重新鉴定，一般是提取待鉴定克隆的重组质粒或噬菌体DNA，用一种或两种酶消化后电泳并转膜，然后用起始探针重新杂交，结合阳性片段的大小来进一步确定阳性克隆。DNA序列分析法是根据阳性克隆的序列与已有信息进行比较，判断筛选到的克隆真假，是一种最准确可靠的鉴定方法。当前87页，总共107页。重组DNA导入宿主的方式转化转导转染感染当前88页，总共107页。转化1928，Grffith在观察肺炎链球菌（Diplococcuspneumoniae）有毒株和无毒株在活体内的相互作用时发现：把加热杀死的S型菌株和活的R型菌株混合培养时，能从中分离出活的S型菌，并能继续传代。定义：来自一个细菌细胞（供体）的DNA（片段）被另一个细胞（受体）所吸收（随后同受体染色体一起进行重组）的过程。

当前89页，总共107页。对DNA的吸收，仅在受体生长周期中的一个短暂阶段。能够吸收DNA的细胞，称作感受态细胞（competentcell）。在转化中有功能的DNA是ds或ssDNA，线状或环状。当前90页，总共107页。（一）CaCl2

转化法

核心：目标细胞在CaCl2·H2O溶液中浸泡一段时间，转化效率107-109

cell/μgDNA。

E.coli:DH5α,TG1,XL-1Blue,JM105

（1）冰上30min

（2）热激42℃90"

（3）恢复1～2min

（4）复苏37℃45-60min

当前9