第3章基因组物理图谱构建

第3章基因组物理图谱的制作3.1限制性酶切作图3.2基于克隆的基因组作图3.3荧光标记原位杂交作图3.4序列标签位点（STS）作图3.5人类基因组图谱物理作图：采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置限制性作图（Restrictionmapping）克隆重叠群（Clone-basedmapping）荧光标记原位杂交（Florescentinsituhybridization,FISH）序列标签位点作图（sequencetaggedsite,STS）基因组光学图谱技术绘制物理图的方法限制性作图（Restrictionmapping）：将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置原理：比较不同限制酶切产生的DNA片段的大小。第一种酶切：电泳确定DNA片段的大小，第一组片段第二种酶切：电泳确定DNA片段的大小，第二组片段两种酶混合酶切：第三组片段利用加减法确定酶切位点的相对位置。3.1限制性作图（Restrictionmapping）5小于50kb的DNA片段，常采用6碱基识别顺序的限制酶大于50kb的DNA片段：稀有切点的限制酶稀有切点的限制酶的选用：1识别序列越长则产生的片段越长2识别位点的碱基组成3通过转座子引入较长的识别位点4基因组DNA的甲基化状态交变电场大片段的电泳分离原理：一个方向不断变换的电场取代简单的电场，使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，达到分离的目的E.coli

基因组NotI限制性酶切位点物理图大肠杆菌基因组物理图3.2基于克隆的基因组作图大片段DNA文库的构建克隆重叠群的组建指纹作图11大片段基因组文库的构建基因组DNA的分离克隆载体的制备基因组片段与载体的连接连接产物在受体细胞的转化和增殖重组子的筛选、鉴定和保存大片段克隆载体P1YAC（YeastArtificialChromosome）BAC（BacterialArtificialChromosome）MAC（MammalianArtificialChromosome）PAC（P1-derivedArtificialChromosome）BIBAC（Binary-BAC）TAC（petentartificialchromosome）1983年Murray等人将酵母菌着丝点、复制原点、端粒组装在一个载体上，构建了第一个酵母人工染色体。1987年Burke等构建了一个YAC载体，将人的DNA大片段插入YAC。

YAC载体插入片段大（理论上大于1000Kb），因此基因组覆盖率高。酵母人工染色体（YAC）载体YAC载体元件着丝粒：在细胞分裂时负责染色体均等分配端粒：位于染色体端部的特异DNA序列，保持人工染色体的稳定自主复制起始点（autonomousreplicationsequence,ARS）：在细胞中启动染色体的复制15端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。形态学上，染色体DNA末端膨大成粒状，像两顶帽子那样盖在染色体两端，因而得名。在某些情况下，染色体可以断裂，这时，染色体断端之间会发生融合，或者断端被酶降解。但正常染色体不会整体地互相融合，也不会在末端出现遗传信息的丢失（被降解之类）。可见端粒在维持染色体和DNA复制的完整性方面有重要作用。PNAS杂志上的一项研究“Telomerelengthinearlylifepredictslifespan”发现，个体的端粒（这是在染色体的两端形成了保护帽的重复的DNA序列）的长度可能预测寿命。“科学算命”酵母人工染色体（YAC）YAC左右臂各含有1个筛选标记TRP1和URA3，转化菌可在不添加色氨酸和尿苷酸的基本培养基上生长插入外源DNA后，SUP4酶失活，克隆显红色；无插入片段时，克隆显白色CEN4，酵母4号染色体着丝粒ARS1，酵母自主复制顺序OR1pBR，大肠杆菌质粒复制起点嵌合现象严重，在基因文库中，嵌合体占克隆总数的5％－50％，导致重叠群错误YAC插入的DNA较大，序列内发生重排，导致克隆片段与原来染色体的序列不一致YAC有缺失现象，影响YAC库的代表性YAC分离困难，不易与酵母天然染色体分开YAC转化原生质化的酵母菌，转化效率低YAC载体的缺点细菌人工染色体（Bacterialartificialchromosomes,BAC）1992年Shizuya等以大肠杆菌F因子为基础构建了BAC载体pBAC108L。在构建基因组文库时，BAC载体容量不如YAC载体，一般小于350KbBAC载体源于天然的F质粒，F质粒与一般的质粒有两点不同：单拷贝复制；相对分子质量大在宿主菌内单拷贝形式存在，遗传很稳定，即使100代后也未能检测到缺失、重组、嵌合现象以大肠杆菌为宿主，转化效率高，至少比酵母菌的转化率高1000倍BAC以环状质粒形式存在于宿主菌中，一般碱法提取就可分离到DNA可利用菌落原位杂交的方法筛选目的基因。BAC兼顾了Cosmid和YAC的优点，克服了稳定性差的问题。克隆片段较大，可达300kb以上BAC克隆载体的优点细菌人工染色体（BAC）pBAC载体为mini-F的衍生质粒oriS和repE介导F因子的单向复制ParA和ParB维持低拷贝和稳定复制CosN为噬菌体末端酶专一切割位点，loxP为P1Cre蛋白作用位点，均可将环状BAC变为线性分子CM为氯霉素筛选标记1990年Sternberg发展了噬菌体P1克隆系统，可用来分离和扩增大至100Kb的片段。Ioannou等（1994）发展了源于P1的人工染色体PAC，具有P1和F因子的特点，克隆片段可达300kb，通过电转化可将PAC导入大肠杆菌，插入的DNA无明显的嵌合和缺失现象。该系统结合了P1载体与BAC载体的优点，PAC载体不仅有较高的遗传稳定性，还能高效扩增。Gingrich等（1994）以PAC作载体建立了人的第二条染色体的克隆文库

P1人工染色体（P1-derivedartificialchromosomes，PAC）PAC载体loxP位点将载体分为两个结构区：1个结构区含有P1pac

顺序，pBR322复制起点和一段约10Kb来自腺病毒的填充区域；另一结构区含有P1质粒复制控制顺序，kanR,IPTG诱导裂解复制区和正筛选sacBII盒sacB基因编码将蔗糖转变为果聚糖的果聚-蔗糖酶，果聚糖的积累可使大肠杆菌致死，只有外源DNA插入的重组子才能存活1996年，Hamilton等报道了利用BIBAC载体将人的150kb基因组DNA通过根癌农杆菌转化到烟草中获得成功，且后代外源片段遵循孟德尔遗传方式1999年，Liu等构建了拟南芥基因组TAC文库，并依此文库构建了SGR1位点区域的克隆重叠群此类载体质粒既可在大肠杆菌中进行复制，也可在根癌农杆菌中复制，且可以容纳较大的外源片段，因此在基因克隆时可直接构建大片段基因组文库进行染色体步查，以获得候选克隆后直接进行转化功能鉴定大片段转化载体TAC载体petentArtificialChromosomeRB/LB:right/leftborderOD:overdrivesequenceHPT:selectivemarkersacB:selectivemarkerpRiA4repliconofRiplasmid26适用于植物基因组文库构建克隆在大肠杆菌和农杆菌中均稳定存在既可用于染色体步查，又可对克隆片段进行转化验证YAC或BAC克隆片段需亚克隆成小片段后转化验证克隆片段长度为40~80KB克隆载体的比较载体结构寄主插入片段长度（Kb）Plasmid环型大肠杆菌7-10Bacteriaphage线型大肠杆菌17-20Fosmid环型大肠杆菌35-45Cosmid环型大肠杆菌35-47P1Clones环型大肠杆菌70-100PAC环型大肠杆菌100-300MiniF-BasedPlasmid环型大肠杆菌90-105BAC环型大肠杆菌<350YAC线型酵母菌100-2000MAC线型哺乳类细胞?-10000TAC环型大肠杆菌及根癌农杆菌>10028估算某一序列在文库中出现的几率，了解文库的覆盖情况公式：N=ln(1-P)/ln[1-(x/y)]

N克隆数目

x插入片段的平均大小

y基因组大小基因组文库覆盖率重叠群的组建相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重叠群（contig）克隆重叠群的组建方法:染色体步移（chromosomewalking）指纹重叠法染色体步移（chromosomewalking）指纹作图克隆指纹是指DNA样品所具有的特定DNA片段组成，一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的特定的顺序特征。克隆指纹（clonefingerprinting）排序是在基因组范围内查找重叠克隆的最好方法如果两个克隆有指纹重叠，表明这两个克隆具有共同的序列。限制性带型（restrictionpatterns）指纹

指纹作图35限制性片段指纹作图原理限制性片段指纹电泳图36限制性片段指纹重叠判断标准将DNA电泳模式输入计算机，根据程序给定标准判断重叠深度:重叠片段的多少及长度重复序列DNA指纹：将不同克隆的DNA限制性片段电泳后转移到杂交膜中，用一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，如出现相同的杂交带型，可判断这两个克隆是重叠的。重复顺序DNAPCR（repetitiveDNAPCR）或分散重复序列PCR（interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR）指纹3.3荧光标记原位杂交（fluresentinsituhybridization,FISH）原位杂交是用来检测被原位保存的染色体、细胞、组织切片中的核苷酸序列的一项技术荧光标记原位杂交与同位素杂交的原理相同，只是标记物不同。FISH的荧光信号可在显微镜下观测，直接显示探针与染色体杂交的位置染色体原位杂交适合框架图的绘制Chromosomepainting染色体可被某些染料染色，各染色体可由大小及染色体条带区分开来，称为染色体组型分析。人类染色体组型图41FISH在肺癌中检测应用4个基因的融合基因会导致肺癌，分别是ALK、ROS1、RET、NTRK1FISH检查的原理是对目标融合基因的断点两侧的基因片段，也就是目标基因的基因头，和基因身体，分别设计不同颜色的探针，一红一绿。做完杂交后，在显微镜下进行观察，如果发现红、绿两个光点挨得很近，那说明这个基因没有与别的基因发生融合，反之，如果红绿两个光点分开了，那说明这个基因发生融合基因。3.4序列标记位点（STS）作图序列标记位点（sequencetaggedsite,STS）是一小段长度在100-500bp的DNA顺序，每个基因组仅1份拷贝，很容易分辨连锁分析中，位点图距与两个标记之间的交换频率有关STS作图中，标记之间的图距是根据其分离频率来计算的STS作图：通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中STS作图原理45光学图谱技术46通过限制性内切酶对DNA进行原位切割，切割后的DNA片段顺序保持不变；

在切割的位点处加入DNA聚合酶；DNA片段经荧光染料染色后置于荧光显微镜下，采集每个限制性内切酶片段的大小和顺序的信息，信息经转换处理后生成单个DNA分子的限制性内切酶酶切位点图谱。最后根据全部DNA分子限制性内切酶酶切位点图谱的相互重叠部分拼接得到全基因组限制性内切酶酶切位点图谱。光学图谱技术提供了一种全新的基因组测序和拼接策略，虽然该技术不能直接获得基因组DNA的碱基序列，但它可以提供基因组绝大多数Contig的位置和顺序信息，从而辅助基因组的Scaffold构建。4748OpGen全基因组光学图谱技术应用实例光学图谱（OM）是一种基于单分子DNA来构建有序的限制性图谱的方法。通过全基因组光学图谱发现GRCh37中的克隆AP006622存在一段缺失，将这个克隆替换为FP710250后修正了这个错误，提升了参考基因组的质量。3.5人类基因组图谱1987年第一个人类RFLP图谱问世，包括393个RFLP及10个其他多态性标记人类基因组计划提出后，1994年的图谱包括5800个标记，其中超过4000个SSLP，每0.7Mb一个标记遗传图谱501993年，全基因组的克隆重叠群包括33000个YAC，所含DNA的平均大小为0.9Mb1995年的STS图谱，包括15086个STS，每199kb一个标记，随后又补充了20104个STS，大部分为ESTEST图谱表明了基因组不同部分的基因密度遗传和物理图谱为人类基因组计划测序提供了框架物理图谱51国际人类基因组测序策略