生化分析常见交叉污染探讨与对策

生化分析常见交叉污染探讨与对策徐国超

一如何理解交叉污染

在A工程测定中所使用的试剂、样本、反响产物、清洗剂等对B工程的测定产生了不良影响的现象。A工程与B工程不一定是相邻工程。测试工程A试剂、样本等残留测试工程B引发交叉污染的原因生化仪的开展变化①多工程,多样本处理②处理能力的提高(高速化)设计共用机械局部①样本针,试剂针②比色杯③搅拌棒生化仪状态不良,使用不当①清洗力的低下(日常维护欠缺,仪器老化)②生化仪内污垢的积聚③测试顺序安排不当④常规清洗不能有效消除污染二交叉污染的分类

样本针携带污染试剂针携带污染搅拌棒携带污染清洗系统携带污染比色杯污染试剂交叉污染三不同类型交叉污染的鉴别方法及原因

1.样本针携带污染：目前大多数全自动生化分析仪采用循环冲洗式样本针吸取样本，当样本针在清洗不完全，或黏附力增加时，样本残留可能会对下一相邻样本的检测结果造成影响。原因：样品针尖弯曲，特富龙涂层剥落，针堵塞，冲洗水冲洗不充分携带污染率主要是表达样品之间的污染程度样本针携带污染率试验〔一〕同一检测工程浓度相差较大的a标本〔高浓度〕，b标本〔低浓度〕。检测顺序：a1,a2,b1,b2,b3计算：评价：以q小于10%为判断标准。局限性：结果与选择的标本浓度有关系例1：选择高浓度的ALT样本浓度值为2021U/L，低浓度ALT样本第一次检测结果40U/L，第三次检测结果20U/L。通过计算携带污染率q=〔40–20〕/2000*100%=1%。例2：选择高浓度的Cl样本浓度值为140mmol/L，低浓度Cl样本第一次检测结果为86mmol/L，第三次检测结果为80mmol/L。通过计算携带污染率q=〔86–80〕/60*100%=10%。上例中，例1的携带污染率尽管只有1%，由于结果正好在医学决定水平附近因此对临床判断有较大影响。例2的携带污染率尽管到达了10%，但是对于临床判断不会产生大的影响。因此，使用该方法评价样本针携带污染需考虑样本的实际浓度。测试顺序：3L2H1L2H4L2H1L2H1L2H1L〔注上述顺序前的数字代表测试数量，如3L代表连续测试3个低值样本〕定义：L–L值为紧跟在低值标本后低值标本的结果。H–L值为紧跟在高值标本后低值样本的结果携带污染指标=H–L结果的平均值–L–L结果的平均值判断标准：当携带污染指标小于3SDSD是(L–L)结果的SD值。样本针携带污染率试验〔二〕试剂针携带污染全自动生化分析仪一般采用双试剂针，即所有工程的一试剂都共用试剂针R1，所有工程的二试剂都共用试剂针R2。试剂针R1或R2在每吸取一次试剂后都会进行一次清洗，之后会立即吸取下一个工程的试剂。当自身清洗能力下降，试剂针在吸取试剂时会将局部残留的前工程试剂成分带入到后项目反响杯中，对后工程的检测结果造成影响。从各个工程设置的参数可知，试剂体积量远大于样本体积量。因此试剂针携带污染影响程度会高于样本针携带污染。携带污染实验方案目前大局部实验室开展的生化检测工程至少都有20项以上，评价全工程之间的携带污染会非常耗时，试剂本钱消耗量大。且不同仪器的动作原理不完全相同，设计一个较为简单，合理的实验方法是需要重点考虑的内容。试剂针携带污染实验方案原理：通过设置特定的标本检测顺序，每个样本只做一个工程的检测，可以控制不同工程的先后吸取顺序，实现任何一个工程都能与其他工程相遇。为了有效评价工程之间携带污染影响程度，污染实验所用病人样本的混合血清应尽量包含医学决定水平浓度试剂针携带污染实验方法携带污染初实验假设本次实验以A,B,C,D,E五个工程来考察各个工程之间的试剂针携带污染,先在生化仪中输入样本测试号码和选择工程，每个样本号码只选择一个工程，目的是使试剂针吸取工程的顺序完全按照样本测试号码的先后顺序进行，五个工程的测试顺序见表1。测试完成后，将数据输入到处理表格2和表格3中，按照一定的判断标准，寻找可能存在的污染工程组合。表3中显示了试剂之间携带污染初实验后的结果:a将表格内测试顺序号代表的位置处输入该工程对应的测试结果，b对每个测试顺序号下面对应的测试结果和该工程单独5次重复结果的均值相比比值以百分比形式表示，通过考察百分比的大小来初步判断携带污染的可能性。目前的判断标准以正负百分之五作为判断标准，超过范围时疑心有携带污染。试剂针携带污染确认实验由携带污染初实验筛选出疑心有污染的工程组合，假设(A→B)同(D→E)即A工程对B工程〔A工程做好后紧接着做B工程〕，D工程对E工程〔D工程做好后紧接着做E工程〕疑心有污染。由于初实验的工程交叉结果只是一次测试的结果，可能有偶然因素，还必须进行确认实验。以(A→B)为例，(D→E)的情况相同先单独做A工程，紧接着连续测试3次B工程，第一个B工程的结果受A工程影响最大，第三个B工程的结果因为有2次自身冲洗，结果应比较准确。比较第一个B工程检测结果同第三个B工程检测结果，如果影响百分比同初试结果影响趋势和程度相近，可以判断A工程对B工程有携带污染。确认实验检测顺序以(A→B〕,(D→E)为例确认实验步骤〔表4〕AB1B2B3DE1E2E3

搅拌棒污染：试剂与样本、第一试剂与第二试剂的混匀需要搅拌棒，而搅拌棒如果清洗不完全，或黏附力增加时，残留试剂可能会对下一检测结果造成影响。鉴别对同一份血清标本重复测定GGT或ALT或AST20次以上，结果重复性较差且有走高趋势。原因搅拌棒特富龙涂层剥落，搅拌棒外表有顽固性污渍，冲洗水冲洗不充分,可用无水乙醇擦洗搅拌棒

搅拌棒携带污染4.清洗系统携带污染鉴别：在样本测定过程中加做室内质控，局部工程测定异常或者失控在样本测定过程中以蒸馏水为样本，屡次测定LDH、P、Mｇ、TBA，结果重复性不好。原因：枯燥棒携带污染为多5.比色杯污染生化分析仪的比色杯大体分为两种，一种是循环使用的〔如石英比色杯等〕，另一种是需要定期更换的〔如塑料比色杯等〕，每个比色杯检测完毕后，进行清洗，然后继续下一个检测工程的检测。当由于各种原因导致某个比色杯清洗不完全或该比色杯老化时，吸附在比色杯上的上一个工程的残留试剂可能会对在这个比色杯中进行的下一个工程的检测结果造成影响。根据经验，比色杯的污染对结果影响最大，因为比色杯最难以清洗干净，且在实际工作中难以判断该比色杯上一测试的工程。鉴别：在每日早晨刚开机时对所有工程做试剂空白测定，试剂空白吸光度高〔终点法〕或者试剂空白吸光度变化率高〔速率法〕TBA〔循环酶速率法〕经常出现负值蛋白工程、血脂工程结果偏高胆红素〔钒酸盐法〕易出现异常值原因：比色杯划痕较深较多，清洗系统清洗不彻底比色杯污染实验方法以工程A对B﹑C﹑D﹑E4个工程比色杯污染不同类型的交叉污染的发生几率由高到低排列：试剂针携带污染搅拌棒携带污染比色杯污染样本针携带污染清洗系统携带污染用排除法鉴别不同类型的交叉污染的排列顺序〔在保证试剂质量没有任何问题的前提下〕：样本针携带污染比色杯污染试剂针携带污染搅拌棒携带污染清洗系统携带污染试剂交叉污染---类型1.试剂成分间的直接影响2.试剂成分间的间接影响3.反响进程相同4.影响反响条件试剂交叉污染1.试剂成分间的直接影响前一个测定试剂中直接含有后一个测试试剂所要测定的工程。例如：通常在AMY的R1试剂中含有Ca离子〔酶活化剂〕,当某样品作AMY和Ca这两个检测工程时，检测的顺序是先检测AMY，接着检测Ca。因吸取过AMY的R1试剂针上可能沾有残留的R1试剂，所以当R1试剂针再吸取Ca试剂时，会引入AMY的R1试剂中含有的Ca离子，这样对Ca工程的检测结果就可能造成正误差试剂交叉污染常见试剂成分间的直接影响葡萄糖〔GLU〕〔氧化酶法〕、总蛋白〔TP〕与酸性磷酸酶〔ACP〕试剂中含有较高浓度的钾〔K+〕；胆碱酯酶〔ChE〕、总胆固醇〔CHOL〕、GLU〔GOD法〕、尿酸〔UA〕〔尿酸酶法〕、乳酸脱氢酶〔LD〕〔IFCC法〕、羟丁酸脱氢酶〔HBDH〕〔DGKC法〕等试剂中含有磷酸缓冲液；CHOL、TG试剂及高密度脂蛋白胆固醇〔HDL-C〕试剂中含有胆酸钠；丙氨酸氨基转移酶〔ALT〕〔IFCC法〕、天冬氨酸氨基转移酶〔AST〕〔IFCC法〕试剂中含有高活性的LD；以上试剂的交叉污染就分别会对、K+〔紫外酶法〕、磷〔P〕、总胆汁酸〔TBA〕及LD的测定结果造成干扰试剂交叉污染2.试剂成分间的间接影响试剂成分参与反应：上一个试剂中含有的某种试剂成分与下一反响所要测定的底物有作用，因而干扰下一反响的测定结果。如：Mg2+测定试剂的络合剂亦能与铁〔Fe〕结合，影响铁与铁络合剂的结合；直接胆红素〔DBil〕〔重氮法〕试剂含有EDTA，Mg2+试剂中含有EDTA，均能与Ca结合，从而影响Ca的测定；以甘油作为酶保护剂的试剂，会对TG的测定带来干扰；钙〔MTB法〕试剂对K+有负干扰；CHOL试剂中含有胆固醇酯酶，可水解胆固醇酯形成游离胆固醇，而引起对游离胆固醇测定的干扰。试剂交叉污染〔3〕反响进程相同：上一个试剂所引导的反响对下一个工程的反响进程带来间接的干扰，下一工程所测定的是前后两个工程反响的综合作用结果。如：当上一反响产物为H2O2时，那么对以Trinder反响产生颜色的测定结果引起干扰，如UA对CHOL结果的影响，CHOL对肌酐〔CREA〕〔酶法〕测定结果的影响，GLU〔氧化酶法〕对CREA测定结果的影响；CK〔NAC法〕、CK-MB〔NAC法〕试剂中含有GLU成分，其分析方法的原理中包含GLU的己糖激酶〔HK〕反响过程，因此可能对GLU的测定带来干扰，尤其对GLU的HK法测定可能带来严重干扰。试剂交叉污染〔4〕影响反响条件：如上一试剂缓冲液成分改变了下一反响的pH环境，从而改变反响速率，如TP〔双缩脲法〕测定需在pH8～9时，蛋白肽键才都能与碱性铜溶液作用生成紫色反响，假设pH＜8时，那么会导致TP结果偏低，还直接影响球蛋白、白蛋白/球蛋白的结果；酶活性测定有最适pH，大多数酶反响pH在6.0～7.5之间，ALP、γ-GT、LDH那么在碱性条件下最适宜；CREA〔苦味酸速率法〕反响条件为碱性，果糖胺〔动力学法〕反响条件为酸性，受到污染后反响速率会减慢。CREA〔酶法〕试剂中含有抗坏血酸氧化酶，影响了氧化复原反响的进程，会对TBA〔酶循环法〕测定结果有影响。DBil〔钒酸盐氧化法〕试剂中含有外表活性剂的酒石酸盐缓冲液会影响ALT活性，对测定结果有负干扰。如何消除试剂间的化学污染〔1〕为减少试剂间的化学污染，应定期对仪器进行适当的保养，如更换管道，用去污剂、酸性洗液清洗比色杯，用去污剂擦清试剂针，用无水乙醇擦洗搅拌棒等。〔2〕合理安排检测工程的顺序：一般在安排工程顺序时要求两个工程间至少要有一个非干扰工程，由于各厂商试剂盒原理不同，内含成分不同，故无固定的测定顺序格式，需要自己摸索。较好的做法是将被干扰工程置于干扰工程之前，以消除干扰发生的可能。一般检测顺序有以下原那么：①不受上一试剂的干扰；②不影响下一试剂测定；③不影响测试速度；④充分运用剩余试剂位开展新工程；⑤利用好仪器的功能。〔3〕当合理设置测试顺序无法消除交叉污染时，可使用生化分析仪的试剂针、比色杯清洗程序，对试剂针、比色杯进行2次或屡次清洗。用碱性清洗液及酸性清洗液交叉冲洗试剂针可以有效地防止携带污染。〔4〕选用具有抗交叉污染的试剂盒：如在游离胆固醇试剂中添加胆固醇酯酶抑制剂，以减少胆固醇酯酶水解胆固醇酯而引起对游离胆固醇测定的污染。〔5〕局部大型全自动生化分析仪有多个模块或通道，可以将有化学污染干扰的工程排在不同的模块或通道中检测。第一类：前一测试工程试剂中含有紧跟其后测试工程所要测定的底物。此时残留的污染物被带入下一测试中，与该测试的试剂反响，可能会导致结果异常。引起这类交叉污染产生的物质明确，并且可以定量分析。主要工程有：1.ALT(IFCC法),AST(IFCC法)含高活性的LDH,会影响其后的LDH结果。2.CK-NAC、CK-MB-NAC酶偶联测定试剂含高浓度Glucose,会干扰其后的血糖测定，尤其对HK法干扰严重。3.Glu(GOD法)、UA(尿酸酶法)、a-HBDH、TG、Ca(偶氮胂III法)、TC(CHOD-PAP)等均采用磷酸盐缓冲液,会干扰位于其后无机盐(P)的结果。4.ALP(IFCC-AMP法)，CK-NAC,CK-MB-NAC,TG(GPO法)试剂均含高浓度Mg2+会影响紧随其后的Mg2+的结果。5.TC、HDL-C、HDL-C、LDL-C采用胆固醇氧化酶法的试剂含胆酸钠，会干扰紧跟其后的TBA结果，致假性偏高。6.以对一硝基苯麦芽七糖苷法(4NP-G4)为底物的AMY试剂含Ca2+浓度高会影响其后测Ca2+的准确性。7.TG，TC试剂中有LIP，会导致LIP的测试结果不真实。该种类型的交叉污染单试剂终点法的受污染工程测试结果的抬高或降低反映的是搅拌杆的携带污染。因为试剂针携带进来的上一个测试的干扰物会和下一个试剂发生反响，由于携带量小，一般在试剂空白段〔2min〕即反响平衡。而双试剂工程的测试结果反映的是试剂针和搅拌杆的综合污染。第二类：前一测试工程试剂中的某种〔些〕成份干扰紧随其后测试工程所要测定的底物。引起这类交叉污染产生的物质明确，但和第一类不同的是，前一测试残留并带入下一测试的污染物并非待测物本身，而是能与待测物进行其他的反响或显色物质波段重叠或引起测试条件的变化如PH值改变等，从而带来对测试过程的干扰，这种干扰作用不易进行定量分析。主要工程有：1.TC、HDL-C、HDL-C、LDL-C最终反响都是过氧化氢和4-氨基安替比林在过氧化酶的作用下产生醌亚胺显色〔505nm〕，因此这些工程间会相互干扰。2.TP的检测原理是蛋白质与铜离子生成紫蓝色复合物，该显色物质在546nm有吸收峰，在波段500nm~600nm都有较大吸收；因此TP试剂可能影响500nm-600nm波段的终点法显色测定〔如TC，TG，UA等〕。另外，TBIL〔重氮法〕和DBIL〔重氮法〕生成的偶氮物在546nm下有吸收峰，因此TBIL〔重氮法〕或D-BIL〔重氮法〕会和TP相互干扰。3.ALB〔BCG〕检测原理是形成的蓝绿色复合物在578nm有强吸收，且在整个500nm-700nm都有较强吸收，因此ALB试剂会干扰紧随其后的500nm-700nm波段的终点法显色测定〔如UA等〕。4.ALT的R2〔含NADH〕及CR的R2试剂〔苦味酸，呈深黄色〕在340nm有很强的吸收，会干扰紧随其后的340nm免疫比浊终点法的测定〔如PA，CRP等〕，且免疫比浊法的终点吸光度越低干扰越严重。该种类型的交叉污染无法分出是试剂针还是搅拌杆携带进的污染对测试结果的影响，是两者的综合影响。四解决方案1.

当交叉污染程度较轻时，设置防交叉污染清洗程序，增加对样本针、试剂针、比色杯的清洗次数。2．

合理设置实验工程的排列顺序，防止试剂交叉污染。ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA、ALP、GGT、CHE、TP、Alb、Urea、UA、Cr、CK、CK-MB、α–HBDH、LD、Glu、TG、TC、HDL-C、LDL-C、APOAI、APOB、Amy、CO2、P、Fe、Ca、Mg。(仅供参考)3．

当交叉污染程序较重时，应对仪器做大保养和维修，更换相应部件。4.每个实验工程所需的样本量、试剂量不要随意同比例降低，以保证反响液保持较大的缓冲能力。设置特殊清洗程序实验方法同确认实验，假设确认实验确认了A工程对B工程存在污染。在仪器中设置A工程B工程进行特殊清洗。选择特殊清洗液〔仪器内部水，碱性清洗液，酸性清洗液〕。一般先设置仪器内部水，设置清洗液量，可根据工程