new实验七GST酶亲和层析及

new实验七GST酶亲和层析及第1页/共43页根据蛋白分子特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。

性质

方法分子大小透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀电荷电泳、离子交换层析吸附性质吸附层析(羟基磷灰石层析、疏水作用层析)对配体分子亲和层析的生物亲和力蛋白质分离纯化的方法第2页/共43页等电点沉淀法聚乙二醇沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法热变性沉淀法蛋白质分离纯化1．电泳法2．层析法3．沉淀法4．透析、超滤5、离心6、结晶第3页/共43页主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。一、粗分级分离第4页/共43页（1）盐析(Salting-out)向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[(NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl等]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。常用的盐析剂是硫酸铵，其盐析能力强，水中溶解度大，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。第5页/共43页第6页/共43页蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常选用透析法或凝胶过滤。

透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在蒸馏水(缓冲液)中进行，可不断更换蒸馏水，直至杂质被除去。透析袋蛋白质溶液蒸馏水（2）透析(Dialysis)第7页/共43页（3）等电点沉淀蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。第8页/共43页(4)有机溶剂法与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶剂引起蛋白质变性的原因有二：降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。室温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。可在不断搅拌下将预冷的有机溶剂逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同蛋白质。第9页/共43页二、细分级分离一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。常用柱层析方法：分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。常用电泳方法：PAGE、等电聚焦电泳(IEF)。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。第10页/共43页细菌中外源GST酶的分离纯化及鉴定1、细菌中外源GST蛋白的诱导表达(IPTG诱导)2、细菌的裂解（溶菌酶法）3、Glu-Aragrosebeads亲和层析分离GST蛋白4、GST蛋白的SDS纯度鉴定综合实验第11页/共43页亲和层析的原理亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。第12页/共43页在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。配基必须偶联于不溶性母体(matrix)(又称载体或担体)上，常用的载体主要有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载体偶联，或不易与配对分子载体结合。为此通常在载体和配基之间接入不同长度的连接臂(spacearm)。第13页/共43页Affinitychromatography

亲和层析SolidMatrixligand第14页/共43页亲和层析法分离生物大分子示意图配基待分离的生物分子a.载体手臂配基亲和吸附剂b.第15页/共43页d.与待分离物质专一可逆结合的物质c.样品杂质

第16页/共43页亲和层析的示意图第17页/共43页GST酶的亲和层析Glu-Agarosebeads

原理谷胱甘肽(Glutathione，Glu)与谷胱甘肽转移酶(

GluS-Transferase)之间具有特异性的作用力。将混合菌体蛋白与谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠（Glu-Agarosebeads）孵育，凝胶手臂上的Glu可以与GST蛋白特异性结合，通过洗脱除去不能与珠结合的杂蛋白而获得琼脂糖珠结合的GST纯蛋白。进一步使用还原型谷胱甘肽(GSH)洗脱时，将竞争GST上的结合位点而将GST蛋白洗脱下来，从而获得纯化的GST酶的纯品。第18页/共43页操作步骤一、细菌诱导培养⑴取一支冻存的B菌，无菌条件下解冻后取20μl放入20ml含氨苄青霉素（Amp，100ug/ml）的培养液中，培养过夜。⑵取培养12~14h后的小量培养菌液2ml放入250ml含Amp的LB培养液中扩大培养3~5h后至OD600为0.6~0.8，加入1MIPTG250μl诱导培养3~6h后，收集菌液。⑶将菌液每3-4ml/管收集在Ep管中，离心后弃上清。第19页/共43页二、GST酶纯化⑴在含细菌沉淀的Ep管中加入500μl的裂解液悬浮细菌，再加入50μl溶菌酶溶液，反复在手中颠倒振摇30min，直至管内液体变得清亮，10000g,离心5min后收集上清。（留存10μl上清于一新Ep管中做对照）⑵将收集的剩余上清直接放入含有50μl50%Glu-Aragrosebeads的EP管中，混匀管内液体，振摇反应5min后，2000g离心1min，然后小心去除珠子上方的上清溶液。⑶在Ep管中加入预冷的PBS洗液1ml悬浮珠子，2000g离心1min，小心去除上清溶液，重复用PBS洗珠子8次以上,最后一次用5000g离心2min。最后将珠子上方的溶液尽量吸干净，注意操作中尽量避免珠子被溶液带走。⑷在收集的珠子中加入20μlGSH溶液悬浮珠子（注意不要颠倒Ep管，以免珠子粘在管壁上），室温反应5min后，10000g离心1min后收集上清溶液（即纯化的GST蛋白）至一新Ep管中。（回收含有珠子的Ep管）第20页/共43页聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定蛋白质常规PAGE

不连续PAGE

SDS

固相pH梯度IEF(IPG-IEF)

双向电泳第21页/共43页聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的多聚体。能得到孔径不同、范围广泛的凝胶物质，重复性好。机械强度好，弹性大，有利于电泳后进行各种处理。无电渗作用。设备简单，所需样品量少，分辨率高。用途广泛：分离分析蛋白质、核酸、多肽等大分子物质；毫克水平材料的准备；蛋白质、核酸分子量的测定…….第22页/共43页凝胶聚合原理 化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。光聚合核黄素B1还原型游离基聚合反应光照O2第23页/共43页聚丙烯酰胺凝胶的合成丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝胶催化剂聚合反应第24页/共43页单体丙烯酰胺Acr交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis化学聚合光聚合引发剂（NH4)2S2O8（NH4)2S2O8

核黄素

加速剂TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8

过硫酸胺在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应

TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺

DMAPNβ－二甲基胺基丙晴聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲撑桥连接而成的三维网状结构物质第25页/共43页凝胶的孔径单体和双体在凝胶中的总浓度a+bV×100%T＝双体占总浓度的百分含量，即交联度ba＋b×100%C＝a，Acr的质量（g）b，Bis的质量（g）V，溶液的体积（ml）C＝6.5％-0.3TT：5％～20％孔径大小第26页/共43页蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系蛋白质相对分子质量范围(kD)适用的凝胶浓度（T%）＜1020－3010－4015－2040－10010－15100－5005－10＞5002—5

凝胶浓度的选择第27页/共43页聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构稀溶液浓溶液－

－交联剂

凝胶－－结点第28页/共43页不连续PAGE的分离效应浓缩效应分子筛效应电荷效应可分离：1.电荷性质与密度相近的但分子量有差别

2.分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别的分子

3.电荷性质、分子量大小相近，但构型不同不连续凝胶电泳洗脱碱性不连续－分离酸性样品酸性不连续－分离碱性样品第29页/共43页①

浓缩效应1.缓冲液与凝胶的离子成分和pH值不同。Cl-，Gly-，蛋白质离子。快慢离子迁移快慢的差别造成电场强度与电导率的变化。低导电区和高导电区。蛋白质样品迁移率在快慢离子之间，压缩聚集成一条窄带。2.两层凝胶的孔径不同：浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶第30页/共43页②分子筛效应移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的pH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，直至完全解离出gly-,其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳动，依其分子量的大小而分开。第31页/共43页③电荷效应

蛋白质所带的净电的性质和电荷量与分子的迁移率的关系，在同一电场强度中，在单位时间内各分子迁移的距离的差别而到达分离。第32页/共43页SDS依据被分离的蛋白质分子大小而进行分离，主要用于测定蛋白质亚基的分子量。SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，蛋白质解聚为多肽亚基。SDS是一种阴离子去垢剂，带负电荷。蛋白质多肽与SDS分子按比例结合(1.4gSDS/1g蛋白质)成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bRf，MW为分子量，Rf为迁移率，k、b均为常数SDS第33页/共43页影响因素溶液中SDS单体的浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单体浓度低于0.5mmol/L，两者的结合比仅为1:0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～100mmol/L用SDS处理样品同时用巯基乙醇或DTT处理，完全还原蛋白质内的二硫键，使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。有些蛋白质不能用SDS测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。第34页/共43页蛋白质样品收集蛋白质含量测定蛋白质上样行SDSSDS鉴定酶蛋白纯度

第35页/共43页操作步骤

1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的烧杯.

2.

把玻璃板在灌胶支架上固定好.

※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.

3.按比例配好分离胶,用滴管快速加入,之后加少许蒸馏水封胶,静置30－40分钟.

※配制凝胶要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝胶无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免凝胶不均匀.

※封水的目的是为了使分离胶上沿平直，并隔绝空气，促使凝胶聚合过程；

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.

4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入分离胶面上,迅速插入样梳,静置40分钟.

※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.第36页/共43页ddH2O3.90ml30%凝胶贮液3.33ml分离胶buffer2.50ml10%SDS100μl10%AP100μl10%TEMED100μl⑴配胶，先配分离胶，再陪浓缩胶。（在孵箱里或水浴锅中聚合）10%分离胶配方：（10ml,一块胶）

操作步骤第37页/共43页（2）4.8%浓缩胶配方：（5ml）ddH2O3.345ml30%凝胶贮液0.8ml浓缩胶buffer0.625ml10%SDS50μl10%AP50μl10%TEMED50μl

操作步骤第38页/共43页5.拔出样梳。插入电泳槽，倒入缓冲液体，用缓冲液冲洗样品孔

※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.6.加样前蛋白样品浓度的测定（每个样品孔内可加入蛋白20-100μg)。7.上样：在含有样品的Ep管中加入10μl的2XSDS上样buffer混匀溶液，对照管中加入10μl上样buffer，沸水浴煮5min后方可上样(用微量注射器距槽底三分之一处进样,注射器不可过低,以防刺破胶体,)