利用聚酮类生物合成研发新抗生素的进展

利用聚酮类生物合成研发新抗生素的进展报告人：2014年12月当前1页，总共34页。目录聚酮化合物简介聚酮类物质合成途径1234聚酮类新抗生素研究进展聚酮类新抗生素研发策略5展望当前2页，总共34页。聚酮类化合物的定义聚酮类物质：聚酮（Polyketides）是一类由细菌、真菌、植物与动物所生产出来的次级代谢产物（secondarymetabolites）。

聚酮化合物是功能和结构最多样化的天然产物之一，它们的合成包括酰基-CoA活化羧酸的一系列重复的醇醛缩合而形成有一定长度的聚酮链骨架，然后经过环化或者芳香化、或者与脱氧糖等结构单位连接等过程。红霉素结构图当前3页，总共34页。一、聚酮化合物的分类1.芳香族聚酮化合物乙酸通过缩合(起始单位除外)形成的，大部分β-酮基在酰基链的延伸和完成后都一直保持非还原状态，经过折叠和醇醛缩合形成六元环，芳香环随后被脱水还原，如放线紫红素、柔红霉素、四环素。复当前4页，总共34页。一、聚酮化合物的分类2.非芳香环聚酮类化合物/大环内酯类化合物构成单位有乙酸、丙酸和丁酸等，许多不经过折叠和芳香化，而是通过内酯化成环，有一部分仍保持酰基链，如大环内酯抗生素红霉素和螺旋霉素、抗真菌抗生素雷帕霉素和两性霉素、聚醚类抗生素莫能霉素和南昌霉素等。当前5页，总共34页。二、聚酮化合物的合成途径1.碳骨架的合成

聚酮合酶PKS（I、II、III类）类似脂肪酸的合成过程2.官能团的修饰羟基化、脱氧、烷基化等当前6页，总共34页。二、聚酮化合物的合成途径a.I型PKS由几个多功能的多肽组成，每一个多肽上都分别携带有参与聚酮生物合成所必需的各种酶的结构域每个结构域只参与整个聚酮碳链构建中的一步生化反应，而参与一轮聚酮生物合成反应的所有结构域称为一个合成酶单位，编码这个合成酶单位的DNA称为一个模块。

当前7页，总共34页。I型PKS合成红霉素当前8页，总共34页。二、聚酮化合物的合成途径b.II型PKSⅡ型PKS是一个多功能酶复合体，只包含一套可重复使用的结构域（KS/AT、ACP、CLF/KSβ），每一结构域在重复的反应步骤中被多次地用来催化相同的反应，其首次报道是在1984年。II型PKS合成机制的研究不如I型透彻。当前9页，总共34页。II型PKS合成丁省霉素当前10页，总共34页。二、聚酮化合物的合成途径c.III型PKS主要分布于植物界，但在少数细菌及真菌(枯草芽孢杆菌、链霉菌和米曲霉等)中也存在，它是一种同二聚体酶并可重复进行缩合反应。

I型和Ⅱ型PKS常常通过ACP活化酰基-CoA的底物，而Ⅲ型PKS直接作用于酰基-CoA活化的简单羧酸。尽管结构和机制不相同，但所有类型的PKS都是通过酰基-CoA的脱羧缩合和KS结构域或亚基催化C-C键的形成。当前11页，总共34页。三、聚酮类新抗生素研发策略聚酮类化合物成为研究热点的主要原因有：(1)无可比拟的生物学活性使之具有巨大的新药物开发潜力和商业价值，聚酮化合物所形成的药物已用于几乎所有重要的疾病治疗；(2)独特的结构和合成机制为人们研究酶催化的分子机制、分子识别和蛋白质的相互作用提供了空前的契机；(3)聚酮合酶所具有的可塑性可以使人们方便地通过组合生物合成手段来获得新的化合物。当前12页，总共34页。三、聚酮类新抗生素研发策略1.聚酮合酶的组合生物学

C-C骨架改造，通过编辑聚酮生物合成基因来设计杂合产物比如：

模块的减少、增加、替换；模块中结构域的减少、增加、替换；

前体指导下的新聚酮化合物的合成当前13页，总共34页。三、聚酮类新抗生素研发策略2.合成后修饰生成新的聚酮

官能团的修饰在碳原子框架上带上其他的功能基团，以增强其生物活性

羟基、羧基、双键、脂肪酸、氨基酸甲基化或形成糖苷。

合成后糖基化修饰是另一条重要的生产新聚酮化合物的途径。3.非核糖体多肽（NRP）-聚酮杂合抗生素的研究当前14页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展1聚酮合酶中模块的减少

聚酮链的构成单位与催化它形成的PKS模块是一一对应的，因此，聚酮链的长度可以通过改变延长单位模块的数目来完成，前提是最后一个模块和环化酶结构域必须能够识别非天然的中间产物。例如：利用基因工程方法重新调整TE的位置，使TE重新和一个、两个、三个或五个DEBS模块组合，结果产生了新的截短了的PKS，并合成了预期的二酮、三酮、四酮和六酮化合物，除二酮外，其它的几个聚酮化合物都以内酯环形式存在当前15页，总共34页。1聚酮合酶中模块的减少当前16页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展2聚酮合酶中模块的增加Rowe等将来自S．hygroscopicus合成雷帕霉素PKS的模块2、模块5分别插入截短的DEBSl一TE模块1和模块2之间，合成了在相应位置多出一个结构单位的四酮化合物；将雷帕霉素PKS的模块2、模块5分别插入全长DEBS的模块1和模块2之间，则合成了多出一个结构单位十六元环的聚酮化合物。当前17页，总共34页。当前18页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展3聚酮合酶中模块的替换

Marsden用avermectin的起始加载模块取代红霉素的起始加载模块构建的糖多孢红霉菌突变体，通过添加不同的前体合成了新的C13位为异丙基、2-丁基等红霉菌A、B和D衍生物当前19页，总共34页。当前20页，总共34页。

3聚酮合酶中模块的替换这方面的一个成功例子是在委内瑞拉链霉菌中利用质粒系统将苦霉素（Pik）PKS亚基替换成泰乐菌素（Tyl）和红霉素(DEBS)的PKS亚基。其整个PKS聚合系统被替换后，外源的PKS模块生产出了新的活性聚酮分子；得到的28元环和24元环内酯化合物与预期的目标结果相一致。委内瑞拉链霉菌的合成后修饰酶（DesVII糖基转移酶和Pikc羟化酶）能以这些新合成的产物为底物，合成有活性的糖基化和羟基化大环内酯化合物。四、聚酮类新抗生素研发进展当前21页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展4模块中结构域的减少

在红霉素PKS模型提出时，为验证模型的正确性，Donadio等通过同源重组同框缺失DEBS3中模块5的KR5结构域的80个氨基酸，正如预料的那样，突变体合成了新的在C5位是酮基的红霉素衍生物5，6-dideoxy-3a-mycarosyl-5-OXO-erythronolideB另一个类似的实验是针对DEBS2模块4中烯酰基还原酶结构域(ER4)的功能失活，它衍生的大环内酯中C6-C7由单键变成了双键当前22页，总共34页。当前23页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展5模块中结构域的增加

McDaniel等将红霉素PKS的模块2的KR替换为来自于雷帕霉素PKS的模块4的DH-KR，相当于模块2比原来多增加了一个DH结构域，使原有的羟基发生了脱水，形成了C=C双键，最后被修饰为羰基，酮化的红霉素衍生物是一类新发现的半合抗，对许多药物敏感或抗性的细菌病原都有很强的活性。当前24页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展6模块中结构域的替换

不同PKS模块选用不同的聚酮链延伸单位，延伸单位的选择是由每个模块的AT结构域控制的，AT结构域的替换也可以导致新的聚酮化合物的产生。Lin等第一次尝试在全长的PKS中进行结构域的替换，他们将红霉素PKS模块6的甲基丙二酰专一性AT替换成来自于雷帕霉素PKS模块2的丙二酰专一性AT，结果在产物中产生在C2位缺少一个甲基侧链的新化合物

当前25页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展当前26页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展7前体指导下的新聚酮化合物的合成

用破坏PKS模块1的KS结构域活性，再通过添加适当前体合成新的聚酮化合物。Jacobsen等尝试了用不同前体产生化合物的构想，他们首先获得了红霉素合成途径中第一步缩合步骤被阻断的突变株，然后再通过外加不同的人工合成的小分子化合物，得到不同的聚酮化合物当前27页，总共34页。当前28页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展9通过合成后修饰生成新的聚酮在碳原子框架上带上其他的功能基团，以增强其生物活性

羟基、羧基、双键、脂肪酸、氨基酸甲基化或形成糖苷，合成后糖基化

Trefzer等的研究表明，在合成乌达霉素的链霉菌中urdGT基因编码的C-糖基转移酶具有灵活的底物选择性，它不仅可以利用一系列的糖-供体底物，还可以利用不同的受体底物，并能在原来没有糖基的位置上添加糖基，用这种方式可在非天然底物上加上糖基化部分。当前29页，总共34页。四、聚酮类新抗生素研发进展10非核糖体多肽-聚酮杂合抗生素研发

非核糖体多肽-聚酮杂合抗生素是另一种形式的抗生素。非核糖体多肽（NRP）是由细菌和真菌产生的一大类具有生物活性的天然产物，如免疫抑制剂（环孢素）和抗生素（青霉素、万古霉素和杆菌肽），是由非核糖体多肽合成酶（NRPS）将简单的氨基酸单体连接修饰而成，非核糖体多肽和聚酮随时截然不同的2类天然物质，但NRPS和PKS可采取非常相似的策略进行合成。正式这种结构和催化机制的惊人相似性，可将NRPS和PKS的模块杂合形成NRPS-PKS体系，并成功应用于多种天然产物的合成，如抗肿瘤药物博来霉素，该药已成为研究杂合肽/聚酮的模式系统。当前30页，总共34页。博来霉素当前31页，总共34页。五、展望1聚酮合酶作用机制有待进一步研究一些新型PKS催化机制表明，天然产物生物合成机制的复杂性远远超出了我们现有的认识，如对于KS催化C-O键生成的发现打破了PKS中KS只能催化C-C键形成的常规，对于这些生物化学机制的揭示还需要在概念和实验设计上有所突破。2基因功能的研究需进一步阐明

聚酮合成酶相关基因对应的酶结构域之间的