专题一基因工程

专题一基因工程第一页，共三十三页，2022年，8月28日一、DNA重组技术的基本工具（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1.分布：2.特点：

特异性，即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且切割每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，使之断开。主要从原核生物中分离纯化出来第二页，共三十三页，2022年，8月28日GAA

TTCCTT

AAGGCTTAAGAATTCCCC

GGGGGG

CCCCCCGGGGGGCCC︰︰︰︰︰中轴线︰︰︰︰↓↑EcoRⅠ（在G与A之间切割）SmaⅠ（在G与C之间切割）粘性末端平末端切割DNA分子产生的两种不同的末端（箭头表示酶的切割位点）↓↑3.结果：在识别序列中轴线两侧切割，产生粘性末端；在识别序列中轴线处切割，产生平末端。第三页，共三十三页，2022年，8月28日GCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG（二）DNA连接酶——“分子缝合针”第四页，共三十三页，2022年，8月28日GCTTAAAATTCG（二）DNA连接酶——“分子缝合针”第五页，共三十三页，2022年，8月28日（二）DNA连接酶——“分子缝合针”2.连接酶的部位：磷酸二酯键，不是氢键GCTTAAAATTCG磷酸二酯键磷酸二酯键1.连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子第六页，共三十三页，2022年，8月28日3.连接酶的类型（按来源分类）(1)E.coliDNA连接酶：(来源于大肠杆菌)只能连接双链DNA片段互补的粘性末端(2)T4

DNA连接酶：（来源于T4噬菌体）既可以连接双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端第七页，共三十三页，2022年，8月28日（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.作用：2.条件：

能在宿主细胞内复制并稳定地保存；具有多个限制酶切位点,便于目的基因插入；具有标记基因，便于筛选；必需是安全的，对宿主细胞无害。

将外源基因送入受体细胞第八页，共三十三页，2022年，8月28日3.种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒质粒细菌拟核DNA之外能自主复制的小型双链环状DNA分子；DNA分子上具有多个限制酶切割位点；能在宿主细胞中进行自我复制；DNA分子上具有特殊的标记基因；对宿主细胞无影响。第九页，共三十三页，2022年，8月28日二、基因工程的基本操作程序获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因检测与鉴定第一步第二步第三步第四步第十页，共三十三页，2022年，8月28日（一）目的基因的获取1.从基因文库中获取目的基因（1）基因组文库

将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。（2）部分基因文库

受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。第十一页，共三十三页，2022年，8月28日（3）基因文库的构建基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库第十二页，共三十三页，2022年，8月28日2.利用PCR技术扩增目的基因(1)原理

PCR是聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）,它是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。第十三页，共三十三页，2022年，8月28日第十四页，共三十三页，2022年，8月28日2.过程高温变性(DNA解旋)（90~95℃）低温退火(引物结合)（55~60℃）中温延伸(互补链合成)（70~75℃）

双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。多次重复3.特点：指数形式扩增第十五页，共三十三页，2022年，8月28日推测推测合成3.通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因

当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。第十六页，共三十三页，2022年，8月28日（二）基因表达载体的构建

用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。第十七页，共三十三页，2022年，8月28日质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA（二）基因表达载体的构建第十八页，共三十三页，2022年，8月28日1.构建目的

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.构建零件及其作用（1）目的基因（2）启动子

RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。（二）基因表达载体的构建第十九页，共三十三页，2022年，8月28日（3）终止子

一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。（4）标记基因

鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。（二）基因表达载体的构建2.构建零件及其作用(5)

复制原点第二十页，共三十三页，2022年，8月28日（三）将目的基因导入受体细胞

将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。

基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。

导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。第二十一页，共三十三页，2022年，8月28日（1）农杆菌转化法1.导入植物细胞（2）其他方法

基因枪法花粉管通道法第二十二页，共三十三页，2022年，8月28日移植显微注射分裂分化发育2.导入动物细胞(显微注射技术)含目的基因的表达载体动物的受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性动物输卵管或子宫转基因动物第二十三页，共三十三页，2022年，8月28日3.导入微生物细胞(2)优点

繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。(3)常用受体细胞

大肠杆菌（E.coli）(1)过程

制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易于接受外源DNA分子。

重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。(Ca2+

处理法)第二十四页，共三十三页，2022年，8月28日（四）目的基因的检测与鉴定

目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。

常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。第二十五页，共三十三页，2022年，8月28日适当限制酶切割用同位素标记的目的基因片段杂交1.分子水平（1）检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因提取受体生物全部DNA许多DNA片段显出杂交带（表明目的基因已插入）（分子杂交技术）第二十六页，共三十三页，2022年，8月28日第二十七页，共三十三页，2022年，8月28日(2)检测目的基因是否转录出了mRNA提取受体生物的mRNA用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已转录出了mRNA）

检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。1.分子水平（分子杂交技术）第二十八页，共三十三页，2022年，8月28日（3）检测目的基因是否翻译出蛋白质（抗原—抗体杂交技术）提取受体生物的蛋白质与相应抗体杂交显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）1.分子水平（分子杂交技术）第二十九页，共三十三页，2022年，8月28日2.个体水平例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。第三十页，共三十三页，2022年，8月28日1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是（）

A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒

B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达

C.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶

D.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒C2.下列关于基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（

）

A.一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列

B.限制性内切酶的活性受温度的影响

C.限制性内切酶能识别和切割RNA

D.限制性内切酶可从原核生物中提取C第三十一页，共三十三页，2022年，8月28日含重组质粒土壤农杆菌抗虫基因含kan质粒重组质粒A构建土壤农杆菌导入B培养选择侵染转基因抗虫植株离体棉花叶片组织愈伤组织C诱导选择再生植株分化D检测3.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：（1）A过程需要的酶有_____________________________________。（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是

__________________________________________________。（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入________________。（4）如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用

___________________________________________作为探针。限制性内切酶和DNA连接酶具有标记基因；能在宿主细胞内复制并稳定保存卡那霉素放射性同位素（或荧光分子）标记后的抗虫基因第三十二页，共三十三页，2022年，8月28日（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。①将转基因植株与________________________杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡