高滴度的生长分化因子-15多克隆抗体制备,基因工程论文

高滴度的生长分化因子-15多克隆抗体制备,基因工程论文生长分化因子〔growthdifferentiationfactor-15,GDF-15〕又名MIC-1、PDF、PLAB、PTGFB或NAG-1,是转化生长因子〔TGF-〕超家族成员[1].GDF-15是一种分泌型二聚体蛋白，其基因位于19号染色体的p12.1-13.1,翻译后的前体蛋白由308个氨基酸残基组成，经剪切生成2条含112个氨基酸残基的多肽链，再通过分子间二硫键构成同源二聚体的成熟形式后，分泌到胞外发挥功能[2].GDF-15高表示出于胎盘和成人的前列腺组织中，而在其他组织中低表示出。在病理和应激环境下，GDF-15的表示出量明显升高。多项研究表示清楚，GDF-15不但介入免疫反响[4-5],与多种心脏疾病的诊断、预后存在相关性[3],而且与多种肿瘤的发生发展密切相关[6,7].大量文献表示清楚GDF-15在很多肿瘤组织中高表示出，能够作为结肠癌、前列腺癌、胰腺癌的血清早期诊断标志物[8].与其他TGF-超家族成员类似，GDF-15能够通过活化细胞外表TGF-Ⅰ型和Ⅱ型受体，进而募集并激活下游Smad信号通路来发挥其相应的生物学功能，可能在肿瘤发生的早期阶段发挥抑瘤作用，而在晚期阶段转而促瘤[9-10].本实验室前期研究发现，GDF-15与肿瘤免疫逃逸密切相关[6],是潜在的肿瘤治疗靶标，我们拟采用抗体特异性阻断的方式方法在动物水平检验其靶向治疗的可行性。但市售的GDF-15抗体种类少、价格高，难以知足实验需求。因而，在本研究中，我们通过基因工程技术构建重组融合蛋白GDF-15的原核表示出系统，获得纯度较高的抗原蛋白，在这里基础上制备了高滴度的GDF-15多克隆抗体，为后续靶向治疗研究的开展奠定基础。1材料与方式方法1.1材料BALB/c小鼠来自第四军医大学实验动物中心；HT29、sw480、caco-2结肠癌细胞购自ATCC;大肠杆菌BL21、DH5，pET-32a〔+〕载体由本实验室提供。反转录试剂盒、限制性内切酶、DNA聚合酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自OMEGA公司；抗GDF-15抗体购自Abnova公司；兔抗人-actin一抗、HRP标记的二抗购自中杉金桥公司；其他试剂均为分析纯产品。据已报道的人GDF-15基因编码区序列设计上游引物〔5-CGGGATCCATGGCGCGTGCGCG-3〕和下游引物〔5-CCCTCGAGCTATATGCAGTGGCAGTCTTTGG-3〕，由上海生工公司合成。1.2重组质粒pET-32a〔+〕-GDF-15的构建提取人结肠癌细胞HT29的总RNA,反转录成cDNA,设计GDF-15特征性引物，体外扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，回收克隆片段，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到经同样双酶切的pET-32a〔+〕载体上，将连接产物用CaCl2法转入大肠杆菌DH5感受态细胞中，接种到含氨苄西林的LB琼脂糖培养板中，37℃孵箱中培养12h,挑选出阳性克隆，提取质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定，将构建的质粒命名为pET32a〔+〕-GDF-15.1.3重组GDF-15的诱导表示出和纯化将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21菌株，挑选单克隆，将含pET-32a〔+〕-GDF-15质粒的大肠杆菌BL21接种于含氨苄西林的LB培养基中，37℃振荡培养，参加终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，培养6h后收集菌体，参加5倍SDS上样缓冲液，混匀煮沸10min,12000r/min离心5min,SDS鉴定GDF-15的表示出。经SDS鉴定挑选出GDF-15高表示出的菌落，诱导表示出，离心收集菌体，将菌体重悬于细菌裂解缓冲液中，冰上超声波裂解〔功率300W,超声5s,间歇10s〕，离心20min,弃上清，用8mol/L尿素溶解包容体。离心后取上清进行Ni亲和层析纯化，以10倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤3次，洗脱缓冲液洗脱重组蛋白并收集，SDS检测纯化后的GDF-15蛋白。1.4GDF-15蛋白的复性与鉴定对变性的蛋白进行复性，分别用8、6、4、2mol/L尿素和不含尿素的PBS溶液对GDF-15蛋白进行透析，每次6h;对复性后的蛋白经SDS鉴定相对分子质量；SDS后，用300mA电流转膜1h,室温封闭2h,用1∶3000稀释的GDF-15一抗于4℃孵育过夜，用1∶5000稀释的二抗于室温孵育1h,Western印迹鉴定能否为GDF-15蛋白。1.5GDF-15多克隆抗体的制备将纯化的蛋白用PBS稀释并与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，经皮下多点注射免疫6~8周龄雄性BALB/c小鼠〔80g/每只〕；2周后，将蛋白与等量不完全弗氏佐剂混合，充分乳化后加强免疫；每2周加强免疫一次，末次免疫14d后取血，分离血清，分装后-20℃保存备用。1.6GDF-15多克隆抗体效价检测采用间接ELISA检测抗体滴度。用100ng/200LGDF-15包被酶标板，4℃过夜后弃掉液体，参加5mg/LBSA封闭缓冲液〔0.1mol/LNaHCO3,pH8.6〕于37℃封闭2h;倾去液体，用TBST〔1mL/LTween-20,TBS〕洗5次，每次2min;每孔参加HRP标记的小鼠二抗抗体〔1∶5000〕100L,37℃孵育1h;用TBST洗3次，参加OPD显色液，37℃显色15min;参加2mol/L硫酸终止反响，用酶标仪测定D490nm值，P/N大于2.1为阳性，设立阴性对照为无关蛋白包板。1.7GDF-15多克隆抗体特异性鉴定取人结肠癌细胞sw480、caco-2,参加强效裂解液，冰上裂解1h,4℃、12000r/min离心20min,BCA法定量蛋白浓度，参加5倍上样缓冲液煮沸10min,经常规SDS后湿转至PVDF膜上，用5%BSA室温封闭1h,参加1∶500稀释的抗血清，4℃孵育过夜，洗涤后用1∶5000稀释的辣根酶标记的抗鼠二抗室温孵育1h,洗涤后ECL显色，压片，保存结果。2结果2.1GDF-15cDNA片段的扩增及重组质粒的制备用特异的上下游引物从结肠癌细胞HT29的cDNA中扩增出GDF-15基因，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1,扩增片段约350bp.将目的基因插入pET-32a〔+〕载体，构建重组质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET-32a〔+〕-GDF-15,也在约350bp处可见GDF-15特异性条带〔图2〕，与预期结果一致。将获得的pET-32a〔+〕-GDF-15质粒测序，结果正确，讲明重组质粒构建成功。2.2GDF-15蛋白的诱导表示出及纯化将转化pET-32a〔+〕-GDF-15质粒的大肠杆菌BL21培养后用1mmol/LIPTG诱导6h,用全菌进行SDS,结果见图3,经IPTG诱导后在Mr约28103处出现明显的表示出产物条带。超声波裂菌后，上清液经Ni亲和层析柱纯化，250mmol/L咪唑洗脱获得目的蛋白峰〔图4〕，PBS透析后行SDS,显示蛋白条带位置正确、纯度较好〔图5〕。2.3GDF-15蛋白的鉴定将纯化的蛋白行Western印迹检测，结果显示原核表示出的GDF-15融合蛋白能够被特异性抗体辨别，抗原性良好〔图6〕。2.4GDF-15多克隆抗体的制备和效价检测将纯化的GDF-15蛋白混合弗氏佐剂，皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，进行1次基础免疫和3次加强免疫，末次免疫后14d取血，分离血清，ELISA检测抗血清效价达1∶100000〔图7〕。2.5GDF-15多克隆抗体检测肿瘤细胞内源性GDF-15的表示出以人结肠癌细胞系sw480、caco-2为检测对象，采用本实验制备的GDF-15抗体进行检测。结果显示，抗体能够检测到胞内GDF-15,产生特异性条带〔图8〕，讲明GDF-15抗体制备成功，可应用于后续研究工作中。3讨论GDF-15在调控细胞应激反响、炎症反响及成体急性损伤修复经过中发挥着重要作用[11],而在肿瘤发生和发展中的功能研究尤为人们关注。针对前列腺癌、乳腺癌和结肠癌的研究显示，GDF-15在血清中的含量与肿瘤组织恶性程度、细胞的增殖和转移能力都存在明显的相关性。还有文献报道，GDF-15能够介导肿瘤诱发的消瘦和厌食症。不仅讲明循环系统中的GDF-15水平能够作为肿瘤诊断和预后的标志，而且这些表示出于肿瘤细胞内的GDF-15也是肿瘤治疗的潜在靶点。为了用抗体封闭GDF-15,以研究其在肿瘤中的功能及其靶向药物的应用前景，我们首先要获得大量的抗原蛋白。当前市售的GDF-15多为CHO细胞表示出，成本高，生产周期长。因而，我们将人GDF-15序列克隆至原核表示出载体pET-32a〔+〕中，构建了重组表示出质粒，并建立了经济、高效的GDF-15原核表示出系统。在这里基础上，我们用传统方式方法制备了高滴度的GDF-15多克隆抗体，通过Western印迹检测了结肠癌细胞sw480、caco-2中GDF-15的表示出，表示清楚我们制备的抗体能有效辨别人源GDF-15分子。以上结果为我们后续研究GDF-15靶向治疗及其生物学功能和信号传导通路奠定了基础。以下为参考文献[1]ConstamDB,RobertsonEJ.Regulationofbonemorphogeneticproteinactivitybyprodomainsandproproteinconvertases[J].JCellBiol,1999,144〔1〕：139-149.[2]UnsickerK,SpittauB,KrieglsteinK.ThemultiplefacetsoftheTGF-familycytokinegrowth/differentiationfactor-15/macrophageinhibitorycytokine-1[J].CytokineGrowthFactorRev,2020,24〔4〕：373-384.[3]SchlittenhardtD,SchoberA,StrelauJ,etal.Involvementofgrowthdifferentiationfactor-15/macrophageinhibitorycytokine-1〔GDF-15/MIC-1〕inoxLDL-inducedapoptosisofhumanmacrophagesinvitroandinarterioscleroticlesions[J].CellTissueRes,2004,318〔2〕：325-333.[4]ZhouZ,LiW,SongY,etal.Growthdifferentiationfactor-15suppressesmaturationandfunctionofdendriticcellsandinhibitstumor-specificimmuneresponse[J].PLoSOne,2020,8〔11〕：e78618.[5]RothP,JunkerM,TritschlerI,etal.GDF-15Contributestoproliferationandimmuneescapeofmalignantgliomas[J].ClinCancerRes,2018,16〔15〕：3851-3859.[6]StrelauJ,SchmeerC,PeterzielH,etal.Expressionandputa?tivefunctionsofGDF-15,amemberoftheTGF-betasuperfamily,inhumangliomaandglioblas