口蹄疫病毒L蛋白酶编码基因SAP区域的定点突变,病毒学论文

口蹄疫病毒L蛋白酶编码基因SAP区域的定点突变,病毒学论文口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdi-seasevirus,FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、接触性传染病。FMDV具有O、A、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ及Asia1共7个血清型,各血清型之间没有穿插保卫,每个血清型又分为很多亚型。FMDV基因组编码4种构造蛋白和9种非构造蛋白,华而不实L蛋白酶是FMDV的一个毒力决定因素。FMDV已经进化出了一些机制以逃避宿主的免疫应答,华而不实L蛋白酶在致病性上发挥着关键作用。L蛋白酶是一个木瓜样蛋白酶,能够将自个与聚蛋白分离。L蛋白酶能够通过半胱氨酸蛋白酶活性切割转录起始因子eIF4G,关闭宿主的翻译,最终导致干扰素表示出水平下降。FMDV缺失L蛋白酶编码区后,其致病力明显减弱。L蛋白酶编码区第47~83位氨基酸处存在保守蛋白域,该区域被称为SAF-A/B、Acinus以及PIAS(SAP)区域,SAP区域通常与调解活化剂和抑制剂之间互相作用的转录控制相关。防控FMD的主要技术手段是疫苗免疫。口蹄疫病毒受自然属性的限制,导致部分疫苗毒株生产性能不高,免疫效力低下。为解决疫苗生产经过中疫苗效价较低、抗原匹配性较差的问题,研究人员利用反向遗传技术获得了嵌合毒株rA-WT-FM-DV。该嵌合毒株解决了这一难题,提高了疫苗效价和产量,能够使疫苗毒株和流行毒株很好地匹配,提高了免疫效力。但是,该毒株的种毒为强毒,存在生物安全隐患。为此,本研究对嵌合毒株rA-WT-FMDV的L蛋白酶编码基因的SAP区域进行了定点突变,以期提高嵌合毒株的生物安全性,进而为进一步研制生物安全性高的疫苗毒株提供生物材料。1材料与方式方法1.1质粒和细胞系重组质粒prA-FMDV(含A/WH/CHA/09构造蛋白的感染性克隆,拯救病毒被命名为rA)由中国农业科学院兰州兽医研究所病毒基因工程课题组构建保存。BHK21细胞由本实验室保存。1.2主要试剂与载体限制性内切酶AflⅡ、PacⅠ,PrimeSTARHSDNA聚合酶、T4DNA连接酶、JM109感受态细胞、DNAMarker等均购于宝生物工程(大连)有限公司。WizardSVGelandPCRClean-UpSystem购于Promega公司。AxyPrepPlasmidminiprepKit为AxyGEN公司产品。Lipofectamine2000、Opti-MEM均为Invitrogen公司产品。MEM细胞培养基与胎牛血清均购自HyClone公司。RNeasyMiniKit购自QIAGEN公司。表示出质粒pcDNA3.1(+)由本实验室保存。1.3引物的设计根据prA-FMDV全长cDNA序列,设计分别含PacⅠ和AflⅡ酶切位点的引物以扩增表示出质粒pcDNA3.1(+)。引物pCD-AflⅡ-F的序列:5-TTTTCCTTAAGGGGCCCGTTTAAACCCGCT-GAT-3,下划线处为PacⅠ的酶切位点;引物pCD-PacⅠ-R的序列:5-CTTACTTAATTAA-GCTAGCCAGCTTGGGTCTCCCTA-3,下划线处为AflⅡ的酶切位点。同时设计在L基因SAP域引入突变的磷酸化引物F-P和SAP-P。F-P:5-GAC-CTCACAGGGCTTGAACTGCACGA-3,SAP-P:5-CTCCGCCTGCTTGGCTGCAAGCGTG-3。1.4L基因SAP区域的突变将表示出质粒pcDNA3.1(+)用引物pCD-AflⅡ-F和pCD-PacⅠ-R进行扩增,得到目的基因片段,同时将重组质粒prA-FMDV经PacⅠ+AflⅡ双酶切后,与上述得到的目的基因片段连接转化至JM109感受态细胞中。把测序鉴定为阳性的克隆命名为pCD-OL。以pCD-OL为模板,用磷酸化突变引物F-P和SAP-P进行PCR扩增,纯化回收PCR产物,经室温连接5min后,转化大肠杆菌JM109。测序鉴定点突变后的阳性克隆,将其命名为pCD-OL-SAP。1.5含有SAP突变的重组质粒的构建将pCD-OL-SAP与prA-FMDV分别用PacⅠ+AflⅡ双酶切后,纯化回收含有L基因SAP区域突变后的目的基因,将其替换到prA-FMDV上,连接转化至JM109感受态细胞中。酶切、测序鉴定为阳性的克隆被命名为prA-SAP-FMDV。1.6重组病毒拯救重组质粒prA-SAP-FMDV在脂质体Lipo-fectamine2000的介导下转染BHK21细胞,同时设立prA-FMDV以及正常细胞对照,将其在含有50mL/LCO2的37℃培养箱中培养4~6h后,用MEM培养基替换转染培养基,继续培养观察细胞病变,待细胞出现90%左右病变时收获病毒。反复冻融3次后再次接种BHK21细胞,直到病毒能稳定地产生CPE,并将该重组病毒命名为rA-SAP-FMDV。1.7拯救病毒的鉴定1.7.1病毒抗原的间接免疫荧光试验(IFA)将收获的细胞毒接种至底部有载玻片的生长BHK21细胞的6孔板里,置于含50mL/LCO2的37℃培养箱中,按常规方式方法做间接免疫荧光试验。一抗为A型FMDV家兔阳性血清,二抗为FITC标记的山羊抗家兔IgG(Sigma公司),同时设立亲本毒株rA-FMDV转染细胞对照和正常细胞对照。1.7.2遗传稳定性的检测收集连续传至第10代和第15代的细胞毒及接种亲本毒rA-FMDV的细胞,用RNeasyMiniKit提取总RNA,然后用RT-PCR扩增含有L基因SAP区域突变的目的基因,并将PCR产物纯化回收后送上海桑尼生物技术公司测序。1.8生物学特性的测定1.8.1对BHK21细胞的毒力(TCID50)将BHK21细胞在37℃含50mL/LCO2的培养箱中培养,待细胞单层长到90%时备用。用MEM以10倍稀释病毒液,将各稀释度(10-3.0~10-8.0)的病毒液分别参加细胞培养瓶,每个稀释度4瓶,同时设立亲本重组毒为阳性对照及空白阴性对照。放入37℃含有50mL/LCO2的培养箱中进行培养,观察3d,用Reed-Muench法计算对BHK21细胞的半数感染量(TCID50)。1.8.2对乳鼠的毒力(LD50)将在BHK21细胞上传代稳定的细胞毒用PBS缓冲液10倍系列稀释,每个稀释度(10-4.0~10-9)经颈背部皮下接种2~4日龄乳鼠,每个稀释度各接种4只,接种剂量为每只200L,同时设立亲本重组毒作为阳性对照组及PBS空白对照组,连续观察7d。记录乳鼠的发病及死亡情况,用Reed-Muench法计算LD50。2结果2.1重组质粒pCD-OL的鉴定质粒pcDNA3.1(+)经过特异性引物扩增后与重组质粒prA-FMDV分别用PacⅠ+AflⅡ双酶切,构建含有5UTR和L基因的重组质粒,获得的阳性质粒经PacⅠ+AflⅡ双酶切鉴定后出现与预期结果相符的片段。2.2含有SAP突变的重组质粒的鉴定将经过点突变的质粒pCD-OL-SAP用PacⅠ+AflⅡ双酶切后替换到prA-FMDV上构建得到SAP区域突变的重组质粒。获得的阳性质粒用PacⅠ+AflⅡ双酶切鉴定,结果出现与预期相符的片段。测序鉴定结果显示,该重组质粒中L基因上SAP区域已被成功突变。2.3重组病毒的拯救脂质体介导转染后第72小时,接种rA-SAP-FMDV的BHK21细胞和接种rA-WT-FMDV的BHK21细胞均出现了明显的CPE,细胞变圆。收取转染细胞上清液继续传代,直至出现CPE的时间缩短,病变愈加典型(见图1)。2.4拯救病毒的鉴定2.4.1病毒抗原的IFA检测接种重组毒株rA-SAP-FMDV的BHK21细胞和接种亲本毒rA-WT-FMDV的BHK21细胞中均有特异性绿色荧光,而正常细胞对照无可见荧光产生(见图2),这讲明接种传代毒的细胞中有病毒的存在。2.4.2遗传稳定性的检测收集传至第10代和第15代的重组毒rA-SAP-FMDV以及传至第15代的亲本毒rA-WT-FMDV,用RNeasyMiniKit提取RNA后经RT-PCR扩增含有L基因SAP区域的基因片段。测序结果(见图3)显示,拯救的重组病毒L基因SAP区域成功突变,且能够稳定遗传。2.5拯救病毒的生物学特性2.5.1对BHK21细胞的适应性及毒力(TCID50)拯救病毒rA-SAP-FMDV可使BHK21细胞产生明显的CPE。经Reed-Muench法计算,拯救病毒rA-SAP-FMDV的TCID50/mL是10-7.17,比亲本毒rA-WT-FMDV的TCID50/mL(10-7.5)略低(见图4)。图4重组毒株rA-SAP-FMDV和亲本毒株rA-WT-FMDV的半数感染量(TCID50/mL)Fig.4Themediantissuecultureinfectiondose(TCID50/mL)oftherecombinantvirusrA-SAP-FMDVandthepar-entstrainrA-WT-FMDV2.5.2对乳鼠的毒力(LD50)接种拯救病毒和亲本毒的乳鼠在接种后第24小时,部分表现出呼吸困难、后肢麻木和用镊子夹尾声音嘶哑等异常感觉和状态。72h后出现异常感觉和状态的乳鼠陆续死亡,阴性对照组乳鼠正常。最后根据统计结果计算出拯救病毒rA-SAP-FMDV的LD50为10-6.5/0.2mL,比亲本毒株rA-WT-FMDV的LD50(10-7.5/0.2mL)略低(见图5)3讨论本研究获得了FMDVL蛋白酶编码基因SAP区域突变的毒株rA-SAP-FMDV。经测定,该重组毒株具有很高的效价。重组病毒rA-SAP-FMDV从第5代到第9代效价(TCID50/mL)稳定在7.17以上,这与亲本毒株rA-WT-FMDV的7.5相当。rA-WT-FMDV是利用反向遗传操作技术将流行毒株的P1基因替换到本实验室保存的O型口蹄疫病毒拯救系统骨架上的。因而,该重组毒株能够很好地与流行毒株进行抗原匹配。这一突变SAP的A型口蹄疫病毒的获得,将为A型FMD疫苗的研制奠定基础。FMD疫苗有很多类型。可是,不管是哪种疫苗都需要7d左右的时间来诱导产生免疫保卫。曾有减毒活疫苗免疫能够引起快速、持久的免疫保卫的报道,比方天花和牛瘟的消灭都是通过减毒活疫苗完成的。FMDV研究中也一直在探寻求索研制能够诱导快速、持久的免疫保卫的疫苗。国外的研究人员曾构建了L蛋白酶编码基因SAP保守域突变的FMDV毒株,用该突变毒株免疫动物,在免疫后早期(免疫后第2~3天)就可明显提升中和抗体水平,同时免疫早期能够抵抗野生型FMDV的攻击;而亲本毒株免疫早期中和抗体没有变化,同时免疫早期不能够抵抗野生型FMDV的攻击。因而,重组病毒rA-SAP-FMDV的获得,将为以后研制免疫应答迅速的A型FMD疫苗提供生物材料。FMDV感染