DB11-T829-2011白菜品种纯度及真实性分子检测方法

北京市地DB11方标准DB11/T829—2011白菜品种纯度及真实性分子检测方法MethodsofidentifyingvarietalpurityandgenuinenessofChinesecabbagebyusingmolecularmarkers北京市质量技术监督局发布IDBT29—2011 DB11/T829—2011前言T市农业标准化技术委员会归口。农业局组织实施。1DBT29—2011本标准规定了结球白菜和不结球白菜种子品种纯度及真实性鉴定的SSR、ISSR分子标记检测方法和交种子及其亲本的品种纯度和真实性鉴定。2规范性引用文件修改单)适用于本文件。GBT3543.4农作物种子检验规程发芽试验GBT543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定3术语与定义SSRsimplesequencerepeatmarker，SSR简单重复序列(SSR),又称短串联重复序列或微卫星序列，它是一类以1bp~5bp的短核苷酸序列为列。erISSR用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。polymerasechainreaction，PCR生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)为底物，使引物得以延2DB11/T829—20114原理简单重复序列(SSR)和内部简单重复序列(ISSR)广泛分布于白菜基因组的不同位置上。每个位点R5仪器设备及耗材5.1仪器设备5.1.1天平(感量0.0001g、0.001g、0.01g、0.1g)。5.1.2水浴锅(0℃~100℃)。5.1.3微波炉(额定功率800W)。.1.4酸度计。5.1.6高速台式离心机(12000r/min)。5.1.7高压灭菌锅。5.1.8冰箱(最低温度-20℃)。5.1.9微量加样枪(0.5µL~10µL,20µL~200µL,100µL~1000µL)。5.1.12紫外分光光度计。5.1.14高压电泳仪(0V~3000V、0mA~400mA、额定功率400W)。5.1.15电泳槽。5.1.16染色盒(55cm×38cm×8cm)。5.1.17水平摇床。5.1.18胶片观察灯。5.1.19数码照相机。5.2耗材离心管(0.2mL、0.5mL、1.5mL、2.0mL)、枪头(10µL、200µL、1mL)、96孔PCR板、一次性手试剂和溶液配制试剂6.1.1乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na2)。3DBT29—20116.1.2三羟甲基氨基甲烷(Tris)。6.1.3盐酸(HCl)。6.1.4硼酸(H3BO3)。6.1.5十二烷基硫酸钠(SDS)。6.1.6氯化钠(NaCl)。6.1.7乙酸钠(NaAc)。1.8Tris-饱和酚。9三氯甲烷。10异戊醇。11异丙醇。.12无水乙醇。A6.1.16DNA标准分子量标记(Marker)。6.1.20N，N’－亚甲基双丙烯酰胺。6.1.21N，N，N’，N’－四甲基乙二胺(TEMED)。1.22过硫酸铵[(NH4)2S2O8]。3尿素。6.1.24亲水硅烷(bind-silane)。6.1.25疏水硅烷(repel-silane)。27溴酚蓝。6.1.29冰乙酸(HAc)。6.1.30硝酸银(AgNO3)。1甲醛。32琼脂糖。3蔗糖。6.1.34溴化乙锭(EtBr)。35超纯水。36蒸馏水。溶液配制引物选用原则及筛选方法用原则4DB11/T829—2011选方法核心引物库8操作步骤1纯度检测株幼苗)作为试样，进行幼苗培养。SSRPCR体积为20uL，反应体系见表1。剂水—µLmmolLµLmmolLµLµmol/LµL10ng/µL~50ng/µLµL5DBT29—2011R剂—20µLR纯水。SSRPCR参数见表2。℃，5min4℃，45s退火：60℃~51℃，1min1.5min4℃，45s℃，45s2℃，1min无限长PCR增仪，应对仪器进行调整。1.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳E电泳检测扩增产物。2真实性鉴定子和标准样品中各随机数取一定数量种子(保证10株幼苗)作为试样，进行幼苗培养。D方法提取样品DNA。ISSRPCRuL见表3。6DB11/T829—2011剂水—µLmmolLµLmmolLµLµmol/LµL10ng/µL~50ng/µLµL—20µL水。PCR5min94℃，1min退火：63℃~54℃，1min℃，1.5min增：94℃，1min53℃，1min，1.5min环n无限长PCR，应对仪器进行调整。2.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳F电泳检测扩增产物。9检测结果9.1纯度计算SSR测定值(品种纯度)：7DBT29—20119.2真实性判定——引物位点差异≥2，判定两个品种为不同品种；——引物位点差异＝1，判定两个品种为相近品种；为疑同品种。——引物位点差异≥2，判定两个品种为不同品种；——引物位点差异＝1，判定两个品种为近似品种；种或极近似品种。8DB11/T829—2011A(规范性附录)的配置方法A.1DNA提取溶液的配制A.1.11mol/LTris-HCl(pH8.0)ml压灭菌。A.1.20.5mol/LEDTA(pH8.0)称取乙二胺四乙酸二钠盐(EDTANa2·2H2O)186.1g溶于800ml蒸馏水中,用NaOH调节pH值至8.0(约NaOHg至1000ml，高压灭菌。A.1.320％十二烷基硫酸钠(SDS)A.1.41%SDS-DNA提取液称取氯化钠(NaCl)58.44g溶于700mL蒸馏水中，加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)50mL，1mol/LTrisHClpH0)100mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，加蒸馏水定容至1L，分装后高压灭菌。A.1.5饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(25:24:1)酚:24份氯仿:1份异戊醇(v/v)A.1.670％乙醇溶液A.1.7TE缓冲液(pH8.0)A.1.83mol/L乙酸钠溶液NaAcgmlpH100ml，A.2PCR扩增试剂配制A.2.1dNTP溶液9DB11/T829—2011超纯水定容至终浓度2.5mmol/L的工作液(也可直接购买2.5mmol/L的dNTP商品溶液)，-20℃保存。A.2.210µmol/L引物溶液A.3聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液配制A.3.16倍变性加样缓冲液A.3.26倍非变性加样缓冲液F0.125g，混匀。A.3.310×TBE缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)108g，硼酸55g，加适量去离子水溶解后，再加入0.5mol/LEDTApH8.0)37mL，去离子水定容至1000mL。A.3.46%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液A.3.55%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液A.3.6亲和硅烷(bind-silane)缓冲液9.75mL和冰乙酸250µL，混匀。A.3.70.5%亲和硅烷(bind-silane)mL缓冲液中加入50µL亲和硅烷原液，混匀。A3.825％过硫酸铵gmL现配。A.3.91×TBE缓冲液TBE00mL，加4500mL去离子水，混匀。A4银染试剂配制DB11/T829—2011A.4.1固定液100mL，加去离子水定容至1000mL。A.4.2染色液2g，加去离子水定容至1000mL。A.4.3显影液30g,量取甲醛5mL，加去离子水定容至1000mL。DBT29—2011(资料性附录)SSR引物序列(5，—3，)Primer—SSR1GGTGGTGGGCTGGGGAGTACGTCGATCGATTCATAACCGTAGAPrimer—SSR2上游ATACAATCTTCGTGACTCTACAG下游AGCATCAACGCCAACTTTATCCPrimer—SSR3ACGCCTCAATTGCTTACTT下游AGGGAATGAGGATGGGTCTGPrimer—SSR4CTCGAAACCCAGCATCAGAGGAATGGAAACCCCAGAAPrimer—SSR5GCTTGCAGAAAGACGAACAGAGCGTAGGCAGGAAAATPrimer—SSR6GCTTGCAGAAAGACGAACAGAGCGTAGGCAGGAAAATPrimer—SSR7CGGCAAAAACGGGCTCATTACTCCGGCTTCTTCCTCACCTCTPrimer—SSR8TTCCAGTAGCCATTGTTGA下游ATCGGGTTTTATACTCCTGAAPrimer—SSR9上游AGCCGCTTCCTTTTCACTCCACTCTTCCTACTTCCCCTCACAGATPrimer—SSR10TCGTTGCGTTTGAATGTTTCGTGGAAGCGGTTACPrimer—SSR11CCTCTCCGGCTTCTTCCTCACCTCGGCAAAAACGGGCTCATTACPrimer—SSR12CTTTTGCTGCCCGACGAGA下游AAGGAAGCAGGAAAGAGATAAAAGPrimer—SSR13GATGGCTCCGGCAAGGTCAACAAAAGATCCAAAAAGAAACPrimer—SSR14TCCGTCCCTTCCCTAAACAGAACACTACTGCCCAGAGAACACPrimer—SSR15CGTCCGTAGCGCTATTTTTCAGA下游ACGTTGTCGATCGCCCAGTTCPrimer—SSR16CGTTGCAGAATGTAGGAAGAGA下游AGAGGGCCCCAAGAAAACTDB11/T829—2011RSSR引物序列(5，—3，)Primer—SSR17CGGCGATGGCTCTTTTCACC下游AAGGATCGTTCAGCGGAGAGTATPrimer—SSR18上游AGTTGGCCCCATTTCATTGTTATCATCTTGACGGCCTCCATCTCCAPrimer—SSR19CAAACTCCCCCAGATCCCCAAACCAGCGCGAACATGAGGAAGAGAAPrimer—SSR20CGCAGAGACGGTTCAGTTACGTGTTACATCTTTATTATCCADBT29—2011(资料性附录)ISSR引物序列(5，—3，)Primer—ISSR1AGAGAGAGAGAGAGAGTPrimer—ISSR2AGAGAGAGAGAGAGAGCGPrimer—ISSR3GAGAGAGAGAGAGAGACPrimer—ISSR4AGAGAGAGAGAGAGAGCCPrimer—ISSR5AGAGAGAGAGAGAGAGGAPrimer—ISSR6GAGAGAGAGAGAGAGACCPrimer—ISSR7AGAGAGAGAGAGAGAGTAPrimer—ISSR8AGAGAGAGAGAGAGAGGCPrimer—ISSR9GAGAGAGAGAGAGAGAATPrimerISSR10GAGAGAGAGAGAGAGATPrimerISSR11GAGAGAGAGAGAGAGATCPrimerISSR12GAGAGAGAGAGAGAGATGPrimerISSR13AGAGAGAGAGAGAGAGTCPrimerISSR14AGAGAGAGAGAGAGAGTTPrimerISSR15AGAGAGAGAGAGAGAGGTPrimerISSR16AGAGAGAGAGAGAGAGGGPrimerISSR17GAGAGAGAGAGAGAGAACPrimerISSR18GAGAGAGAGAGAGAGAAGPrimerISSR19GAGAGAGAGAGAGAGATAPrimerISSR20AGAGAGAGAGAGAGAGATPrimerISSR21GAGAGAGAGAGAGAGACGPrimerISSR22GAGAGAGAGAGAGAGAGT2011DBT8292011ISSR引物序列(5，—3，)PrimerISSR23GAGAGAGAGAGAGAGAGCPrimerISSR24CTCTCTCTCTCTCTCTGPrimerISSR25CTCTCTCTCTCTCTCTGAPrimerISSR26CTCTCTCTCTCTCTCTACPrimerISSR27CTCTCTCTCTCTCTCTGGPrimerISSR28TCTCTCTCTCTCTCTCAPrimerISSR29TCTCTCTCTCTCTCTCCPrimerISSR30CACACACACACACACAGPrimerISSR31CACACACACACACACAGTPrimerISSR32CACACACACACACACAAGPrimerISSR33CACCACACACACACACAPrimerISSR34ACACACACACACACACTPrimerISSR35ACACACACACACACACCPrimerISSR36ACACACACACACACACCTPrimerISSR37ACACACACACACACACCAPrimerISSR38ACATGTGTGTGTGTGTGPrimerISSR39CAGCAGCAGCAGCAGGPrimerISSR40TCCTCCTCCTCCTCCCDB11/T829—2011(规范性附录)D因组DNA提取方法一D.1.1白菜单粒干种子夹在硫酸纸(称量用)中砸碎，放入1.5mL离心管中。每管加入1%SDS-DNA提取液100μL，混匀。单株幼苗放入1.5mL离心管中，每管加入1%SDS-DNA提取液200μL及少量石英砂,用尖碾碎，混匀。D.1.2将1.5mL离心管置于80℃~90℃水浴锅中水浴10min，水浴过程中混匀2~3次。D.5mL离心管从水浴锅中取出，放入离心机中12000r／min离心5min。D.1.4每管取上清液10μL，加入到一个新的1.5mL离心管中，里面预先放入1×TE缓冲液(pH8.0)90D因组DNA提取方法二D.2.1白菜单粒干种子或单株幼苗放入1.5mL离心管中，每管加入1%SDS-DNA提取液300μL及少量石英用尖头玻璃棒碾碎，混匀。D.2.2将1.5mL离心管置于65℃水浴锅中水浴30min，水浴过程中混匀2~3次。D.2.4将每管中的上清液移入到一个新的1.5mL离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，1/10体积的3molL混匀，-20℃冰箱放置20min，充分沉淀DNA。D000r／min离心5min沉淀DNA。D管加入70％乙醇300