DB34T 173-1999公共场所微生物采样方法与检验技术规范

1999—01—01发布1999—01—01实施前言 2引用标准 3监测点的选择与监测频率 5现场采样操作的质量控制 6样品送检的质量控制 本标准是与GB9663～9673—1996、GB16153—1996卫生标准中微生物指标相配套的采样方标准中附录A、附录B、附录C为标准附录。1公共场所微生物采样方法与检验技术规范1范围本标准规定了公共场所微生物检测的选点与采样频率、采样方法与检验本标准适用于公共场所室内空气中细菌总数；公用茶具、毛巾、床上卧肠菌群、致病菌以及脸(脚)盆、浴(缸)盆、座垫、拖鞋中的致病菌的采样与检验工作。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成本标本均为有效。所有的标准都会被修订，使用标准的各方应探讨GB14934—94食(饮)具消毒卫生标准GB/T17220—1998公共场所卫生监测技术规范3监测点的选择与监测频率4采样方法与检验技术规范4.1公共场所空气中细菌总数4.1.1采样点、采样高度与频率采样时选择对空气中的细菌捕获率达95%的撞击式空气微生物采样器，按照仪器使用说明的要求对仪器外表进行处理，对采样装置进行清洁灭菌；将采样时间定的采样时间档上，采样时间的选择视采样点空气含菌量的大致估计情况而定。带所3’档，一般公共场所1’～2’档，将事先准备好的灭菌采样平皿按说明书要求仔细安装好后，即可进行采样，流量以25L/min为宜。采祥结束后，仔细取下平皿，放于平皿储存器中，样品采完后，将带菌营养琼脂平板置36±1℃恒温箱中，培养48=2h,计数菌落数，并安徽省技术监督局1999—01—01批准1999—01—01实施2设置3-5个采样点，设3点时即室内墙角与对角墙角均匀布3点，设5个点时即室内墙角对角线交点为1采样点。该交点与四墙角连线的中点为另外4个采样点。采样高度为1.2~1.5m。2,以代表全皿菌落数。3选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告。若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300之间，则应求出两个稀释度菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2,应报告其平均数，若大于，2则报告其中稀释度铰低的平皿菌落若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告若所稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一个稀释度平均菌落数大于300,而相邻的另一个稀释度平均菌落数小于30,则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每ml小于1cfu。菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数可用10按附录B执行。纸片法：用灭菌生理盐水湿润Scm×5cm大肠菌群快速测定纸片两张，分别粘贴在茶具内、外缘口唇接触处，约30s后取下，置于无菌塑料袋内4h内送检。发酵法：用测定细菌总数剩余的检样，倒入双料乳糖胆盐发酵培养液中，置36±1℃培养箱内培养24h。自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，转种伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18~24h,然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实性试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行染色镜检；同时接种乳糖发酵管，置36纸片法：将已采样的纸片置36=1℃培养箱内培养16～18h,观察结果，44.3.1采样部位毛巾、枕巾(套)采样：应在毛巾、枕巾(套)对折后两面的中央5cm×采样方法(涂抹法)检验方法按执行。菌落计数方法按执行；按下列公式计算菌落报告方式按执行。检验方法按本标准执行。5证实试验：挑取可疑大肠杆菌菌落1-2个，进行革兰采样方法按执行。将大肠菌群检测后剩余的5ml待检样品，放入7.5%的氯化钠肉汤45ml或膜酪胨大豆肉汤从培养液中取1～2接种环，划线接种在BairdPairker氏培养基(或用血平皿),于36=1℃6试管法：吸取1:4新鲜血浆0.5ml放入灭菌小试管中再加入待检菌24h肉汤培养物0.将无菌棉试子蘸取无菌生理盐水，在每只拖鞋规定的部位和面积上涂抹采样后，用反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开，此液为1:10稀释液。用灭菌吸管吸取1:10检液2ml,分别注入到2个灭菌平皿内，每皿1ml另取1ml注人9ml加有玻璃珠的灭菌盐水管中，换1支1ml灭菌吸管吹吸5次，此液为1:100稀释液。7通常选择菌落数在30～100之间的平皿进行计数，同稀释的两个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每ml检样中所含真菌数。若有两个稀释度的菌落数皆在规定范围之间或三个稀释度4.5.6结果报告 注：一只拖鞋的涂抹面积是5cm×5cm=25cm²;一双拖鞋的涂抹面积则为25cm²×2=4.6浴盆、脸(脚)盆中微生物4.6.1采样部位采样必须在无菌操作下进行，采样用具高压灭菌121℃20min,脸(脚)盆采样时应在盆内壁1/2～1/3高度涂抹一圈采样。浴盆应在盆内四壁及盆底呈梅花状布点。4.6.2细菌总数设备与材料按附录B执行。采样方法涂抹法：用漫有无菌生理盐水的棉拭子在规格板(5cm×5cm)内来回均匀涂满整个方格，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将涂抹浴盆的5个棉拭子一并放入125ml的生理盐水烧瓶中，涂抹脸(脚)盆的2个棉拭子一并放入50ml的生理盐水三角烧瓶中，充分振摇或在旋涡振荡器上振荡1min,此1mL的菌浓度相当1cm²的菌量。斑贴法：将5cm×5cm无菌滤纸片放入灭菌平皿中，注入灭菌生理盐水1ml/片(吸满为止),以无菌操作将滤纸片贴到采样部位，1min后按序取下，将贴浴盆的5片滤纸一并放入125ml生理盐水瓶中，贴脸(脚)盆的2片滤纸一并放入50ml生理盐水瓶中，充分振播或在旋涡振荡器上振荡1min,此1ml的菌浓度相当于1cm²的菌量。检验方法按执行。菌落计数方法按执行；按下列公式计算：菌菌总数(CFU/25cm²)=平均菌落数×稀释倍数×25………………(4)菌落计数的报告按执行。4.6.3大肠菌群设备与材料按附录B执行。采样方法8涂抹法和斑贴法：按本标准“”执行。可用细菌总数检测后剩余的样品检测大肠纸片法：用无菌生理盐水湿润大肠菌群快速测定纸片(5cm×5cm)分别贴于采样处，约检验方法按执行。5.1每次采样前应对现场采样人员进行工作前培训.其内容包括采样目的，计划安排、采样技5.2采样都必须在无菌条件下操作。采样用具(如采样器、试管、广口瓶、剪子等)必须经过5.3现场采样前，熟悉仪器性能及适用范围，确保5.4采样前对采样器流量和其他仪器都应该校准或标化处理。校正流量时必须使用现场采样吸5.6采集空气细菌总数样品时应避开人流通风道和通风口，并距离墙壁1m远。6.2采样时认真填写“样品采集记录表”,采样记录的编号应与样品编号一致。采样后应立即贴上标签，每件样品必需标记或登记名称、来源、数量、采样地点、采样人及采样年月日。6.3样品应在4h内送实验室，为防止在运输过程中样品的损失或污染，存放样品的器具必须6.4送检时要认真填写“卫生监测样品送检单”、样品交接单，连同样品一并交实验室，以供9高压蒸汽灭菌器，干热灭菌器，恒温培养箱，冰箱，平皿(直径9cm)。A.1.2营养琼脂培养基A.1.2.2制法将上述各成分混合，加热溶解，校正PH至7.4,过滤分装，121℃20min高压灭菌。用自然沉降法测定时，倾注约15ml于灭菌平皿内，制成营养琼脂平板。撞击法参照A.2检验公共场所茶具、毛巾、床上卧具、浴盆、脸(脚)盆的设备与材料高压蒸汽灭菌器，天平，干热灭菌箱，灭菌平皿：直径9cm。培养箱36±1℃。灭菌刻度吸制法：溶解后，分装到试管内，每管10ml,121℃,20min高压灭菌。另分装125ml/瓶、供浴盆采样使用，50ml/瓶，供脸(脚)盆采样。(标准的附录)B.1检验公共场所茶具、毛巾、床上卧具、理发用具、浴盆、脸(脚)盆大肠菌群的设备与B.1.2检验浴盆，脸(脚)盆的仪器与设备无菌滤纸片，显微镜，酒精灯、恒温箱，旋涡振荡器、载玻片，冰箱(0～4℃)。平皿(φ90mm),试管架。天平(1/千),吸管，三角烧瓶或广口瓶(容量125mL或250mL)倒管，0.04%溴甲酚紫水溶液0.65%美蓝溶液制法：将蛋白胨、磷酸盐水琼脂溶解于蒸馏水中，调PH7.1.分装烧瓶内。121℃高压灭菌15min备用，临用时加入乳糖并加热溶化凉脂，冷至50～55℃,加入伊红和美蓝溶液.摇乳糖0.04%澳甲酚紫水溶液∵115℃高压灭菌15min,加入指示剂，分装带有倒管试管，每管3ml,结晶紫95%乙醇1%草酸铵水溶液碘将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至95%乙醇将涂片在火焰上周定，滴加结晶紫染色液.染lmin,水洗。滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗，滴加95%乙醇脱色，约30S,水洗。滴加复染液，复染1min,水洗，待干，镜检。质量要求：纸片必须符合食(饮)具用大肠菌群快速检验纸片质量标准，每张纸片Scm×Scm,PH值7.0~7.4,包装无菌，生产厂家经卫生部门审核认可。显微镜，培养箱，离心机，灭菌吸管，灭菌试管，载玻片，酒清灯，革兰氏染色用有关器成分：胰酪胨(或胰蛋白胨)植物蛋白胨(或大豆蛋白胨)磷酸氢二钾2.5g蒸馏水1000ml制法：将上述成分混合后，加热溶解，调PH为7.2～7.3,分装，121℃,20min高压灭制法：将上述成分加热溶解，调PH为7.4,分装，121℃,15min高压灭菌。C.蒸馏水950g增菌剂的配制：30%卵黄盐水50ml与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10ml混合，保存于冰制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃校正PH。分每瓶95ml,121℃高压灭菌15min,临用时加热熔化琼脂，待冷至50℃加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5ml,摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。脱纤维羊血(或兔血)10ml制法：将营养琼脂加热溶化，待冷至50℃左右以无菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，制成平氯化钠5gg牛肉膏5g0.2%麝香草酚蓝溶液12ml制法：将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调PH7.4,加入甘露醇和指示剂，混匀后分装试管中，115℃,20min高压灭菌备用。C.1.2.6兔(人)血浆制备取3.8%柠蒙酸钠溶液，115℃,30min高压灭菌