实时荧光定量PCR技术及其在乙肝检测中的应用

实时荧光定量PCR技术及其在乙肝检测中的应用摘要：实时荧光定量PCR法被广泛应用于基础研究，成为分子生物学必不可少的研究工具。与传统的PCR技术相比，实时荧光定量PCR具有快速、高特异性、高敏感度的特点，所以自1985年Mullis发明PCR技术和1988年Erlich发现耐高温的DNA聚合酶以来，该技术以惊人的速度广泛应用于生命科学的各个领域，特别是在细胞学、病毒学、肿瘤学、遗传学、法医学、动植物免疫学等方面取得了巨大的成绩，成为当代分子生物学发展史上的一个里程碑。近年来在乙肝病毒的诊断中，它为乙肝的诊断提供了直接的依据。关键词：实时荧光定量PCR乙肝病毒DNA基本原理Keywords:FQ-PCRHBV-DNABasicprinciples一、引言近年来，随着对乙型肝炎病毒（HBV）分子生物学研究的深入，以及荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测方法的普遍开展，目前对乙型肝炎病毒检测的临床意义已有了新的认识。我们分析不同基因型HBVDNA的序列特点，总结不同基因型的HBVDNA序列的规律性差异，利用实时荧光定量PCR技术建立乙肝病毒基因型的分型方法。本文就荧光定量PCR技术的原理及近年开展荧光定量PCR检测HBV-DNA以来的资料进行综合性叙述。二、PCR技术简介及原理1、PCR定义PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。2、PCR反应成分：（1）要被复制的DNA模板；（2）界定复制范围两端的引物；（3）四种脱氧核糖核苷酸；（4）DNA聚合酶；（5）反应缓冲液、Mg2等。3、PCR反应基本步骤：（1）变性：高温使双链DNA解离形成单链（94°C，30s）；

退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合(55°C,30s)；延伸：中温延伸°DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应(70-72C,30〜60s)。，，，作为荧光阈值的坐标。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2>0.99)，这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量［5,6］。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。，，，三、荧光定量PCR的优点荧光定量PCR是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，实验整个过程只在加样时打开1次反应管，在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量，因此也有人称荧光定量PCR为实时荧光定量PCR。其优点为：1、荧光定量PCR解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题。2、避免了普通定量PCR操作过程中的污染，荧光定量PCR只在加样时打开反应管一次。3、荧光定量PCR操作简便、快捷、结果准确，不需要普通PCR扩增后进行电泳或放射自显影观察结果，方便了临床上的应用。4、荧光定量PCR可以对每一批扩增样本进行扩增效率的评价。对DNA做系列稀释，每个稀释浓度的DNA对数值与其Ct值做回归分析，PCR的扩增效率的计算方法为：效率=10-1/斜率。通过计算扩增效率可以对一起、操作人员和试剂进行综合评定。四、实时荧光定量PCR技术应用（在乙型肝炎病毒检测方面的应用）乙型肝炎是一种世界性传染病，我国是高流行区，我国有50%〜70%的人群受过乙型肝炎病毒的感染，有8%〜10%为乙型肝炎表面抗原携带者，约有一亿人口。乙肝病毒又与肝硬变以及原发性肝细胞肝癌密切相关，我国同时也是肝癌的高发国家。目前，乙肝五项检查为：（1）表面抗原（HBsAg）体内是否存在乙肝病毒；（2）表面抗体（抗-HBs）是否有保护性；（3）e抗原（HBeAg）病毒是否复制及具有传染性；（4）e抗体（抗-HBe）病毒复制是否受到抑制；（5）核心抗体（抗-HBc）是否感染过乙肝病毒。随着技术的发展现在可以通过HBV-DNA检测反映出肝脏内是否有乙肝病毒的存在以及是否在进行复制。在乙肝病毒表面抗原阳性患者及抗病毒治疗后PCRHBV-DNA检测的临床应用研究中得出，HbsAg（+）合并HbeAg（+）者及单纯HBsAg（+）者，其HBV-DNAPCR阳性率最高，均大于95%，与文件报道的检出率97%基本相同。HBV-DNA阳性，说明患者体内病毒复制活跃，此时无论肝功能是否正常或有临床表现，都说明病情处于活动期，具有较有较强的传染性，这与大三阳的临床意义一致，在以往的两对半检测模式中以HBeAg（+）来判断乙肝活动性仍具有较大的临床意义。实时荧光定量PCR还可及时、准确地检测出标本中HBV的拷贝数。研究证实，HBVe抗原阳性的乙肝患者有97%HBV-DNA阳性，HBVe抗体阳性的患者有37%HBV-DNA阳性。结果表明e抗原阳性患者体内大多有乙肝病毒存在，而e抗体阳性患者有37%左右体内存在乙肝病毒复制情况,即此类患者有传染性，需注意与家人的隔离。HBV-DNA（HCV-RNA）结果为101〜105拷贝/ml时，表明病毒复制水平较低，传染性较弱，而当HBV-DNA大于105拷贝/ml时，表明病毒复制水平高，传染性强。另外HBV-DNA定量检测可及时灵敏地监测患者药物治疗的效果。研究结果显示,对于低拷贝量(小于105拷贝/ml)的乙肝患者,干扰素治疗效果尚可，而对于高拷贝量感染的患者，干扰素疗效较差。因此通过检测HBV2DNA水平来决定是否选用干扰素，可大大提高治疗的成功率。1998年底我国药监局批准拉米夫定用于治疗慢性乙型肝炎患者。目前国内外学者对拉米夫定使用有了一个较为明确的范围，其治疗效果可用HBV-DNA含量进行监控，随着拉米夫定的广泛应用，HBV对拉米夫定耐药株的出现引起了大家的关注，耐药株出现后，HBV-DNA水平明显升高，可升高3个指数级以上，随后出现转氨酶及胆红素升高等肝功能损伤标志。耐药株的出现发生在使用拉米夫定治疗28周后，尤其是治疗一年后发生率可达25%。通过HBV-DNA定量检测观察到拉米夫定耐药后，可辅助医生及时调整治疗方案，不至于贻误病情，浪费时间和财力。近年，利用荧光定量PCR技术也可以建立乙肝病毒基因型的分型方法。中国的HBV-DNA的基因型主要以B、C型为主，还有D型，针对B、C、D型特点，设计两对引物，引物I、引物II为B、C型公用的引物，引物III、引物W扩增D基因型；3条探针分别为B、C、D型的特异性探针，B型探针以荧光集团FAM标记，C型探针荧光集团VIC标记，D型探针荧光集团FAM标记。利用常规方法提取HBV-DNA后，进行荧光PCR扩增:一份标本平行进行两种检测，荧光PCR反应体系为25pl，反应一:组成为模板2.5pl，TaqDNA聚合酶1U，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各200pmol，引物1、11各15pmol,B型、C型荧光探针各4pmol,10*荧光PCR缓冲液2.5p】；反应二:组成为模板2.5pl，Tag-DNA聚合酶1U,dATP、dGTP、dCTP、dTTP各200pmol,引物III、W各15pmol,D型荧光探针4pmol,10*荧光PCR缓冲液2.5pl,反应参数为94°C预变性1min,95C变性5s,60C退火和延伸30s，循环40次,荧光检测选择FAM、VIC,设阳性及阴性对照。结果乙肝无症状携带者血清被分型。目前，公认的HBV基因分型方法是根据HBV-DNA全序列的核苷酸差异，即同基因型毒株其序列的同源性〉92%，异型间序列差异N8%。全基因序列分析费用昂贵，技术条件高，一般实验室难以做到，但同基因型的序列可能会有独特的酶切位点，大量HBV-DNA的序列分析提示S基因的序列稳定,不同基因型各开放读框中S基因异质性最大，而同一基因型中S基因异质性最小，故S基因可用于基因分型，笔者既往利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术进行S基因的多态性研究并以此分型，提示可利用酶切位点的差异性来分型。根据酶切位点的差异设计特异性探针进行基因分型，方法更科学，结果更可靠，分型率高，便于临床研究及流行病学调查。总之，进行HBV-DNAPCR检测具有非常重要的意义，不仅可以了解乙肝病毒体内HBV复制水平，还可以对一些抗病毒治疗的患者跟踪了解其病情的归转和预后，对其治疗方案的选择具有重要的临床意义。五、PCR的应用前景及展望目前在实时荧光定量PCR技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR定量方法普遍有的问题有侍解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，研究(RT)效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。另外，与传统的PCR技术相比，实时荧光定量PCR的不足之处是：由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了实时荧光定量PCR的复合式检测的应用能力；目前实时荧光定量PCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。但是实时荧光定量PCR的出现，简化了mRNA的可重复定量和检测过程，并可精确定量。实时荧光定量PCR反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高，结果准确，与传统RT-PCR相比有明显的优势。因此，实时荧光定量PCR在核酸的检测应用中，在临床诊断或大规模的人群分子流行病学调查中，都有广阔的应用前景。一方面，实时荧光定量PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能。另一方面，荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展，使实时荧光定量PCR技术有一个从专业研究到商业检测的全方位应用。总的来说，实时荧光定量PCR技术具有以下发展趋势:定量水平从粗略定量、半定量到精确定量、绝对定量；定量过程中参照物的选择从单纯外参照非竞争性定量到多种参照定量；检测手段从扩增样本终点一次检测到扩增过程中动态连续检测进行定量；检测方法由手工检测、半自动检测发展到成套设备检测，且检测效率及自动化程度越来越高。实时荧光定量PCR技术必将成为未来分子生物学实验室必备的研究工具。可以这么说，现在用到PCR的地方，将来就会用到实时荧光定量PCR技术。六、总结通过大量阅读有关PCR技术原理及其相关应用论文，使得我对PCR这项技术有了一定程度的了解，它除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估；对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手，也可以做DNA指纹(Fingerprints)比对帮助亲子关系的鉴定。PCR更可以用于器官移植组织兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析，经由PCR的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质及各种生长因子基因的表现都可用PCR来进行质与量的分析。参考文献朱传武，罗端德，曾令兰，等.PCR-SSCP法检测乙型肝炎病毒前c区基因变异[J].华中科技大学学报(医学版)，2002,31(04):393-396.罗红权，杨朝国.PCR检测HIV感染的方法进展[J].四川省卫生管理干部学院学报，2003,22(02):128-130.张少静，吕秀文，杨立廷，等.PCR在临床结核病诊治中的价值探讨[J].陕西医学检验，1997,12(02):43-45.刘霞，林森，魏红山，等.T7cDNA噬菌体展示文库筛选乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白[J].中国病原生物学杂志,2007,2(01):8-10.刘德春，孙波，徐群.核酸检测技术与酶联免疫检测技术在血液筛检中的初步应用比较[J].中国输血杂志,2007,20(01):44-45.陈伟烈，蔡晓莉,魏绍静，等.基因芯片技术在乙肝病毒基因型及YMDD变异检测中的应用[J].中国实验诊断学，2007,11(2):207-212.唐宁,杨合贵.聚合酶链反应在幽门螺旋菌检测的应用[J].实用医技杂志，1997,4(04):260-267.许丽艳，敬华，刘春雷，等.酶联免疫吸附和胶体金与荧光定量PCR技术在乙肝病毒检测中的应用[J].总装备部医学学报,2007,9(1):10-12.邓文星，张映.实时荧光定量PCR技术综述[J].生物技术通报，2007,(05):93-95,103.陈国凤，王琳，成军，等.乙型肝炎病毒聚合酶末端蛋白基因芯片研究[J].世界华人消化杂志，2004,12(12):2911-2915.伦永志，雷莎，成军,等.乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的亚细胞定位与结构预测[J].解放军医学杂志，2009,34(3):280-282.崔琨，姬胜杰,侯保全.乙型肝炎病毒载量与肝纤维化形成的相关性研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2008,17(11):957-958.尚世强，董关萍,余钟声，等.应用PCR2RFLP技术检测中枢神经系统感染患儿6种疱疹类病毒DNA的实验研究[J].中国实用儿科杂志，2004,19(10):611-613.石云.应用聚合酶链反应技术(PCR)检测HBV-DNA和HCV-DNA的方法探讨[J].医学动物防制,2005,7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