基因工程专题课时复习

基因工程专题课时复习第1页/共37页基因工程基本工具操作程序生产应用运载体DNA连接酶限制性核酸内切酶目的基因的检测与鉴定目的基因导入受体细胞基因表达载体的构建目的基因的获取转基因动物转基因植物工程菌基因治疗和基因诊断蛋白质工程第2页/共37页DNA重组技术的基本工具

限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

DNA连接酶——“分子缝合针”

基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

第3页/共37页

1、限制酶的作用特点：（体现了专一性）2、限制酶的作用原理：4、用途：5、来源和种类：微生物、几千种3、作用结果：“分子手术刀”——限制性核酸内切酶1）能识别双链DNA的特定核苷酸序列；2）从特定部位的两个核苷酸切开。催化磷酸二酯键断裂形成黏性末端、平末端1）切割目的基因和运载体（基因工程）2）保护自身细胞原有的遗传信息（微生物细胞）第4页/共37页磷酸二酯键ATGGCATCTTCGAA氢键第5页/共37页限制性内切酶限制酶第6页/共37页限制酶所识别的序列有什么特点

限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。第7页/共37页DNA连接酶——“分子缝合针”连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。E·coli连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。第8页/共37页基因的载体——“分子运输车”载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）

4、对受体细胞无害载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。常用的载体有：

质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等第9页/共37页原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因（一）目的基因的获取第10页/共37页真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子非编码序列：包括非编码区和内含子思考：编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核生物与真核生物基因结构一样长吗？第11页/共37页1、目的基因：编码蛋白质的基因（1）从基因文库获取：用限制酶切割DNA,形成许多DNA片段（基因组文库)（2）人工合成法：

①反转录法：用mRNA反转录出DNA片段（cDNA）

②化学合成法：根据蛋白质的氨基酸序列，推测mRNA

序列，再推测DNA序列，然后人工合成DNA（cDNA）2、基因文库:（1）基因组文库:一种生物所有的基因（2）部分基因文库:一种生物的部分基因（cDNA）3、获取方法：第12页/共37页①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：________、_______________、 ___________、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增（3）利用PCR技术扩增目的基因模板第13页/共37页⑥过程：a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的

延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链3′端第14页/共37页利用PCR技术扩增目的基因第15页/共37页1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。——

核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表达载体的构建第16页/共37页基因表达载体的组成：复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因启动子：结合RNA聚合酶开始转录mRNA终止子：位于基因尾端终止转录mRNA标记基因：鉴别目的基因是否导入(筛选)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。第17页/共37页(三)将目的基因导入受体细胞转化导入方法动物细胞——显微注射法(受精卵)微生物细胞——感受态细胞（Ca2+）植物细---目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞表达稳定农杆菌转化法花粉管通道法基因枪法第18页/共37页1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌第19页/共37页2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：

目的基因表达载体提纯取卵（受精卵） 显微注射受精卵新性状动物用Ca2+处理细胞感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子第20页/共37页(四)目的基因的检测与鉴定检测鉴定——①检测染色体的DNA上是否插入目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNA探针和目的基因单链杂交方法：DNA分子杂交方法:分子杂交方法：抗原抗体杂交DNA探针和目的基因的mRNA杂交——检查是否成功第21页/共37页DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。第22页/共37页豇豆对多种害虫具有抗虫能力，根本原因是豇豆体内具有胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI基因）。科学家将其转移到水稻体内后，却发现效果不理想，主要原因是CpTI蛋白质的积累量不足。经过在体外对CpTI基因进行了修饰后，CpTI蛋白质在水稻中的积累量就得到了提高。修饰和表达过程如图所示：

请根据以上材料，回答下列问题：（1）CpTI基因是该基因工程中的

基因，“信号肽”序列及“内质网滞留信号”序列的基本组成单位是

，在①过程中，首先要用

酶切开，暴露出

，再用

酶连接。（2）在该基因工程中，供体细胞是

，受体细胞是

。（3）②过程称为

。（4）检测修饰后的CpTI基因是否表达的最好方法是

。（5）与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是_＿＿＿＿＿＿＿．脱氧核苷酸目的限制性内切黏性末端DNA连接豇豆细胞水稻细胞转录让多种害虫食用水稻叶片打破物种界限，定向改造生物性状第23页/共37页三、基因工程的应用抗虫、抗病、抗逆、改变品质（一）植物基因工程1、加快生长、改善品质（二）动物基因工程2、生产药物（乳腺反应器）3、器官移植（供体）（三）基因工程药品（工程菌：外源基因高效表达的菌系）（四）基因诊断和基因治疗基因诊断：用标记探针通过DNA分子杂交，鉴定遗传信息基因治疗：把正常基因导入病人体内表达，发挥正常功能体外基因治疗、体内基因治疗（五）基因工程与环境保护环境监测（DNA探针检测微生物）污染治理（超级细菌）第24页/共37页

抗虫基因Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等抗病毒基因病毒外壳蛋白（coatprotein，CP）基因；病毒的复制酶基因抗真菌基因几丁质酶基因和抗毒素合成基因抗逆基因调节细胞渗透压的基因、抗冻蛋白基因

、抗除草剂基因优良性状基因提高必需氨基酸含量的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因、与植物花青素代谢有关的基因转基因植物第25页/共37页肠乳糖酶基因外源生长激素基因提高动物生长速度改善畜产品的品质生产药物药用蛋白质基因+乳腺蛋白基因的启动因子作器官移植的供体导入外源的抗原决定基因表达的调节因子，抑制或除去供体的抗原决定基因转基因动物用基因工程方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。基因工程药品包括：细胞因子（即淋巴因子如白细胞介素—2、干扰素）、抗体、疫苗、激素等工程菌:第26页/共37页①获取目的基因（例如血清白蛋白基因）②构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）③显微注射导入哺乳动物受精卵中④形成胚胎⑤将胚胎送入母体动物⑥发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体中，转入的基因才能表达）。实例:基因工程实现动物乳腺生物反应器的操作步骤第27页/共37页将目的基因导入到动物的受精卵里，目的基因若与受精卵染色体DNA整合，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。这样一种新的个体，称为转基因动物。总结：转基因动物基因工程在畜牧养殖业上的应用主要是什么？繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等优良品质的转基因动物。该过程的重要步骤是通过感染或显微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中。第28页/共37页1.基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。取患者骨髓分离干细胞病毒正常基因并入正常基因的干细胞注入患者体内基因治疗曙光初照2.实例：将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，再将这种淋巴细胞转入患者体内。(1)治疗严重复合型免疫缺陷症利用修饰的腺病毒作载体，将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因转入患者组织中(2)治疗遗传性囊性纤维化病第29页/共37页3、基因治疗的类型体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移的治病方法。（如将治疗囊性纤维病的正常基因转入患者肺组织）4、基因治疗的发展现状：处于初期的临床试验阶段第30页/共37页五、基因芯片从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。第31页/共37页一、蛋白质工程崛起的缘由满足人类生产和生活的需要例如：改造干扰素（半胱氨酸）体外很难保存干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍第32页/共37页四、蛋白质工程1、基因工程的不足：只能生产天然蛋白质2、天然蛋白质不足：不完全符合人类需要提高酶的热稳定性、延长药用蛋白的保存期基因表达（转录和翻译）多肽（氨基酸序列）蛋白质（空间结构）行使功能天然蛋白质的合成预期蛋白质功能设计蛋白质结构推测氨基酸序列找到核苷酸序列蛋白质工程途径3、原理：预期蛋白质