免疫检测常用方法及运用秦伟

免疫检测常用方法及运用秦伟第1页/共61页这些方法所具有的特异性好、敏感性高、简单、快速和稳定的特点为临床上确定诊断、分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供有效的实验依据，使它们在临床的应用进一步普及和推广。第2页/共61页凝集反应(agglutination)颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体，或可溶性抗原(亦可用抗体)吸附于与免疫无关的载体形成致敏颗粒与相应的抗体(或抗原)，在有适量电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块。第3页/共61页

凝集反应的分类

直接凝集反应间接凝集反应抗人球蛋白试验（Coombs试验）第4页/共61页直接凝集反应

颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体在有适量电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块。常见的应用是血型的鉴定第5页/共61页血型鉴定示意图第6页/共61页

间接凝集反应

将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集的现象称间接凝集反应（indirectagglutination）或被动凝集反应（assiveagglutination）。第7页/共61页间接凝集反应常用的载体微球有人O型血红细胞、绵羊或家兔红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭/甲苯胺红、明胶颗粒等第8页/共61页间接凝集反应正向间接凝集反应反向间接凝集反应第9页/共61页正向间接凝集反应用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体第10页/共61页正向间接凝集反应

—胶乳凝集试验所用载体颗粒为羧化的聚苯乙烯胶乳，是一种直径约为0.8μm大小的圆形颗粒，带有负电荷，可物理性吸附蛋白分子。将溶血素O吸附在羧化的聚苯乙烯胶乳颗粒上检测抗”O”。将变性IgG包被于羧化的聚苯乙烯胶乳颗粒上检测RF。第11页/共61页正向间接凝集反应

—RPR/TRUST试验血浆反应素试验(RPR)

所用载体颗粒为活性炭颗粒甲苯胺红不加热血清反应素试验

（TRUST）所用载体颗粒为甲苯胺红颗粒第12页/共61页正向间接凝集反应

—RPR试验第13页/共61页正向间接凝集反应

—TRUST试验第14页/共61页正向间接凝集反应

—明胶颗粒凝集试验所用载体为人工合成的惰性明胶颗粒梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）肺炎支原体抗体检测（MP-Ab）第15页/共61页正向间接凝集反应

—TPPA试验第16页/共61页正向间接凝集反应

—TPPA试验第17页/共61页正向间接凝集反应

—MP-Ab试验第18页/共61页正向间接凝集反应

—MP-Ab试验第19页/共61页正向间接凝集反应

—MP-Ab试验第20页/共61页正向间接凝集反应

—MP-Ab试验检测肺炎支原体的总抗体（IgM,IgAIgG)以滴度的方式报告检测结果（<1:801:80、1：160、1:320……)第21页/共61页

反向间接凝集反应

用已知特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。第22页/共61页抗人球蛋白试验

（Coombs试验）抗人球蛋白抗体参与的间接血凝试验，用于检测抗红细胞不完全抗体分类：

直接Coombs试验

间接Coombs试验

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直接Coombs试验

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间接Coombs试验

第25页/共61页凝集反应总结一、直接凝集反应

血型鉴定二、间接凝集反应

胶乳凝集试验ASO/RF1正向间接凝集反应RPP/TRUST

明胶颗粒凝集TPPA/MP2反向间接凝集反应三、抗人球蛋白试验

直接/间接Coombs试验

第26页/共61页酶联免疫吸附试验

（ELISA）①

使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。③标本中的抗原或抗体、酶标抗原或抗体按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应，并通过底物与酶的反应来反映标本中的抗原或抗体的量。第27页/共61页

酶联免疫吸附剂试验

第28页/共61页酶联免疫吸附试验双抗体夹心法双抗原夹心法间接法竞争法捕获法测

IgM抗体第29页/共61页

ELISA—双抗体夹心法

用特异性抗体进行包被和制备酶标抗体，以检测相应的抗原。乙肝标志物中HBsAg、HBeAg的检测常采用本法第30页/共61页

ELISA—双抗体夹心法

第31页/共61页ELISA—双抗体夹心法第32页/共61页

ELISA—双抗原夹心法

用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。抗HBs的检测抗HCV的检测抗HIV的检测第33页/共61页

ELISA—双抗原夹心法

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ELISA—竞争法标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。如受检标本中无抗体，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。加入酶标抗原后就显色深。如受检标本中含有抗体，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗体与固相抗原结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。加入酶标抗原后就显色浅或不显色。第35页/共61页

ELISA—竞争法第36页/共61页

ELISA—竞争法最常见的应用：乙肝HBeAb、HBcAb检测第37页/共61页ELISA—捕获法（1）将抗人

IgM抗体（抗人

IgMµ链抗体）连接在固相载体上，形成固相抗人

IgM。（2）加入标本，

IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他抗体。（3）加入特异性抗原试剂，它只与固相上的特异性

IgM结合，洗涤。（4）加入针对特异性抗原的酶标抗体，形成固相二抗—IgM抗体—抗原—酶标抗体复合物。（5）加底物显色，如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性

IgM抗体存在，是为阳性反应。第38页/共61页ELISA—捕获法以优生四项IgM抗体检测为例第39页/共61页ELISA—捕获法甲肝IgM抗体测定第40页/共61页ELISA总结酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它的最小可测值达ng甚至pg水平。酶免疫测定标记试剂比较稳定，且无放射性危害。因此，酶免疫测定的应用日新月异，酶免疫测定的新方法、新技术不断发展。第41页/共61页固相膜免疫测定利用微孔膜（主要是醋酸纤维素膜）作为固相进行免疫检测的方法根据标记物的不同分为两类：

酶标固相膜免疫测定：

酶免疫斑点法

酶免疫印迹法

金标法：

胶体金斑点渗滤试验

胶体金免疫层析试验第42页/共61页酶标固相膜免疫测定原理第43页/共61页酶免疫斑点法常应用于自身抗体的检测第44页/共61页

酶免疫印迹法

第45页/共61页

胶体金斑点渗滤试验

第46页/共61页

胶体金斑点渗滤试验

第47页/共61页胶体金免疫层析试验金标双抗体夹心法测抗原将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（T）。过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。第48页/共61页胶体金免疫层析试验第49页/共61页胶体金免疫层析试验检测HIV－Ab的双抗原夹心法第50页/共61页金标法的应用HCG的检测第51页/共61页金标法的应用HBs-Ag的检测第52页/共61页金标法的应用大便潜血试验（FOB）第53页/共61页金标法的应用轮状病毒和腺病毒抗原检测第54页/共61页金标法的应用幽门螺杆菌（HP）抗原检测第55页/共61页金标法的应用O1群霍乱弧菌检测第56页/共61页金标法的应用HCV-Ab检测第57页/共61页金标法的应用艾滋病抗体金标检测第58页/共61页金标法总结上述两种试验的共同特点是：简便、快速、单