基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的酶活性分析,分析化学论文

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的酶活性分析,分析化学论文摘要：酶作为生物催化剂介入很多重要的生理经过,同时也是一类重要的生物分子。酶的活性分析对于疾病诊断和治疗具有重要意义。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)具有操作简单、分析速度快、灵敏度高和易于实现高通量分析的特点,已被广泛用于各种组学研究和生物分子的检测,在酶的检测和活性分析中亦发挥了重要作用。该文综述了国内外利用MALDI-TOFMS分析酶活性和进行药物挑选的策略,总结了各种方式方法的优缺点,提出了MALDI质谱技术在酶活性分析领域存在的问题和挑战,并对其发展前景进行了瞻望。本文关键词语：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS);酶活性;均相;非均相;Abstract：Enzymesasbiocatalysts,participateinmanyphysiologicalprocesses,whichareimportantbiomarkers.Theactivityanalysisofenzymesisofgreatsignificancefordiagnosisandtreatmentofmanydiseases.Matrix-assistedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry(MALDI-TOFMS)hasbeenwidelyusedinvariousomicsstudiesandbiologicalmoleculesdetectionsbecauseofitsgoodperformancesinsensitivity,throughput,speedandoperation.Italsohasplayedanimportantroleinenzymesactivityanalysis.ThemethodsofMALDI-TOFMSforenzymeactivityanalysisanddrugscreeningarereviewedinthispaper,themeritsanddisadvantagesofeachmethodarediscussed,theproblemsandchallengesexistedareputforward,andfinallytheperspectivesforMALDI-TOFMSinenzymeactivityanalysisareoutlooked.Keyword：MALDI-TOFMS;enzymesactivity;homogeneous;heterogeneous;酶分子产生于活细胞，其是具有特异辨别底物和催化功能性质的蛋白质或RNA分子，亦是一种极其重要的生物催化剂。人体和哺乳动物体内至少含有5000种酶，在凝血经过、蛋白质代谢、组织再生和免疫防御等很多生物活动中扮演着重要角色[1,2,3,4]。酶活性的改变与糖尿病[5]、阿尔兹海默症[6]、癌症[7]、艾滋病[8]等很多疾病密切相关。酶活性抑制剂能够调控生物经过，用于疾病的治疗，例如:人类免疫缺陷病毒(HIV)患者接受HIV-1蛋白酶抑制剂治疗，能够抑制疾病的发展，延长寿命。因而，发展高灵敏、高效的酶活性检测技术和方式方法，同时有效挑选酶活性抑制剂对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。传统的免疫分析法是通过检测酶的浓度间接确定酶活性。由于酶的浓度并不能直接代表酶的活性，因而常出现假阳性结果[9,10]。针对底物设计的荧光探针，制备经过相对复杂，且光学信号易重叠，不合适多种酶的同时检测[11,12]。质谱法是通过检测酶的底物和产物在酶作用下的信号变化来监测酶活性，方式方法准确性更高层次，而且合适多种酶的同时检测。近年来，利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术将镧系元素标记在多种蛋白酶底物上，应用于多种蛋白酶的测定，获得了满意的结果[13,14]。液相色谱-串联质谱(LC-MS)结合多反响监测(MRM)技术亦被用于定量描绘叙述酶活动，被以为是金标准方式方法[15,16]。与ICP-MS和LC-MS相比，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)具有样品用量少、分析速度快、高耐盐和高通量的优势，在分析经过中能够简化复杂样品的分离、除盐和标记步骤。MALDI质谱离子化和MALDI靶板的修饰及生物芯片技术相结合，能够实现微量样品的在线分离和富集，以及高效的酶活性分析和药物挑选。本文综述了国内外利用MALDI-TOFMS检测酶活性和药物挑选的方式方法。这些方式方法主要分为两类:一种是基于非均相酶催化反响，将酶的底物固定在固体外表上，除此之外表与溶液相中的酶进行反响，再用MALDI-TOFMS进行检测;另一种是基于均相酶催化反响，即底物和酶在溶液相中反响，再用MALDI-TOFMS检测底物和产物。两种方式方法的原理示意图如此图1所示。图1酶活性分析方式方法示意图Fig.1Schematicdiagramofmethodsforenzymeactivityanalysis1、基于非均相酶催化反响1.1、通过共价作用固定底物Su等[17]在金基底上通过Au-S作用自组装单分子层(SAMs)，此生物芯片非常适用于MALDI-TOFMS，因而称为SAMDI(Self-assembledmonolayersfordesorptionionization)技术。如此图2[18]所示，马来酰亚胺基团可与半胱氨酸残基反响进而固定蛋白激酶底物多肽，而寡聚乙二醇的设计能有效地抑制单分子层与蛋白质之间的非特异性作用，确保单分子层只通过固定的配体与蛋白质进行特异性互相作用。这种多肽芯片可用MALDI-TOFMS表征。蛋白激酶活性通过底物肽和产物肽的信号来监测。不同蛋白激酶底物的氨基酸序列不同，因而在一个芯片上固定多种多肽底物，可同时分析多种蛋白激酶。此方式方法评价了激酶抑制剂浓度对于激酶催化作用的抑制效果。图2单分子层合成与酶活性表征的方式方法[18]Fig.2StrategyforsynthesizingmonolayersandcharacterizingenzymesactivitiesbyMALDI-TOFMS[18]除了分析蛋白激酶，Kuo等[19]还将该方式方法运用于其他酶活性检测。通过分析CHRF巨核细胞(Mk)细胞裂解液中赖氨酸脱乙酰酶(KDAC)的活性，验证了该方式方法的可行性。利用类特异性去乙酰化酶抑制剂研究表示清楚，分化晚期的巨核细胞表现为6种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依靠型的去乙酰化酶(SIRTs)活性明显下降，而另11种二价离子依靠型的去乙酰化酶(KDACs1-11)活性变化不大。该研究建立的平台可用于辨别细胞裂解物中多种酶活性的变化。除了将肽段作为金-硫单分子层的固定化底物外，Ban等[20]还设计了直接在生物芯片上制备寡聚糖阵列的方式方法，以快速有效地研究其相关蛋白的生物活性。该方式方法首先将含有苯酚末端的硫醇烷基链组装到金外表，酚基作为亲核试剂与第一个糖结合，再利用糖的末端高效地合成不同的寡聚糖阵列，并检测了-1,4-半乳糖基转移酶的特异性，如此图3所示。除此之外，Kim等[21]通过将带有生物素标记的DNA底物固定在自组装的单层链霉亲和蛋白层上，制备了寡核苷酸阵列。该阵列在3端具有正常匹配和错配碱基对的复合物，还包括该位点的一些删除和插入。用连接酶和三磷酸腺苷(ATP)或三磷酸类似物核苷处理阵列，再用基质辅助激光解吸电离质谱分析，比拟了5-探针链的腺化和连接的产物量。由此揭示了连接酶特异性，并发现使用ATP类似物能够提高酶的特异性。该方式方法可广泛应用于以核酸为底物的酶活性分析。Choi等[22]报道了一种基于在金上自组装单分子层的氯霉素(CAP)乙酰转移酶(CAT)活性的测定方式方法。在乙酰辅酶A存在下，CAT将单分子层上的CAP转化为乙酰化的CAP。利用MALDI质谱技术，通过观察CAP分子质量的变化，直接监测其转化经过。图3在芯片上合成低聚糖的方式方法[20]Fig.3Strategyfortheon-chipsynthesisofoligosaccharides[20]以上方式方法的特点在于将酶底物固定在惰性外表上，通过清洗去除干扰分子，很大程度上简化了样品前处理经过。这种策略基于MALDI-TOFMS的特点提供了一种简单、快速、高通量、免标记的检测方式方法。然而，此方式方法通过共价键(Au-S)固定底物，用MALDI-TOFMS检测时需经过Au-S键断裂经过。因而可能会导致底物和产物测定不完全，影响定量效果。Hu等[23]提出了一种肽编码的酶活性分析微板。将蛋白酶特异性的底物肽段直接固定在微板上，与目的蛋白酶作用后，从微板中释放出编码区域，以单氨基酸差异的相应肽段为内标直接定量分析。编码区域可作为唯一的蛋白酶ID用于辨别相应的蛋白酶，裂解产物的量用于蛋白酶活性分析。以胰酶和糜蛋白酶为模型蛋白酶进行了多重蛋白酶试验，结果显示肽编码微板具有良好的选择性。该方式方法为多种蛋白酶的鉴定和活性定量分析提供了有力的工具，但主要针对蛋白水解酶，不适用于蛋白激酶等其他酶。1.2、通过非共价作用固定底物除了在金-硫单分子层上利用含特殊官能团的硫醇烷基链来固定特殊肽段或寡聚糖来制备阵列，酶底物的固定化经过还可通过非共价作用完成。Sanchez-Ruiz等[24]将疏水自组装单层膜置于金板上作为支架，然后将一系列用脂质修饰的不同寡糖通过疏水-疏水互相作用固定在疏水单分子层板上，构成寡聚糖阵列(如此图4)。基于酶作用后产物的不同，此阵列使区分不同的糖基水解酶活性成为可能，提高了聚糖阵列的构造多样性。随后，Beloqui等[25]利用该方式方法快速检测了环境样品中糖基水解酶活性和特异性。与其他方式方法相比，基于胶体的系统需要优化。此方式方法疏水外表和糖的标记更易制备，而且平面非多孔外表使酶易于接近反响外表和提高稳定性。该方式方法适于环境样品和复杂体液的功能分析。除此之外，该课题组[26]还对单分子层的材料进行了改进，选择商用的ITO涂层玻片，用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)对其硅烷化，然后与硬脂酸偶联，为固定脂质标记的生物分子创造了疏水支撑层。这种单分子层基底可获得更高层次的外表覆盖度和疏水性。聚糖与疏水层结合能构成良好的斑点形态，为酶活性分析提供了良好的基础。然而MALDI-TOFMS检测技术对待测物的质谱响应性要求高，因而质谱响应信号直接影响定性、定量检测的准确性。Hu等[27]用两亲性的磷脂标记蛋白酶底物多肽，通过疏水互相作用固定在硬脂酸改性的ITO载玻片上，组装成不同半胱天冬酶的肽底物阵列，通过对酶裂解前后的肽段进行鉴定能够直接分析多种酶活性。由于磷脂在负离子形式下的离子化效率高，可得到很好的质谱响应信号。因而，该方式方法用于质谱成像获得了良好的可视化结果，具有多重酶活性分析和可视化特点，为酶的活性分析、耐药性鉴定和抗癌药物疗效评价提供了有力手段。图4利用疏水互相作用固定底物和酶活性表征的经过[24]Fig.4Theprocessofsubstrateimmobilizationbyhydrophobicinteractionandenzymesactivitycharacterization[24]2、基于均相酶催化反响2.1、免标记法相比于非均相酶催化反响，均相酶催化反响更有利于底物和酶的接触性。Ritorto等[28]用MALDI-TOFMS技术在体外分析了42个人泛素分解酶(DUB)对所有泛素拓扑异构体(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63-linkedchains)的活性以及特异性，并挑选了DUB抑制剂。此方式方法以同位素标记的N15-泛素为内标，对底物裂解的泛素单体进行定量，得到了良好的线性关系(如此图5)。为减少干扰，在用MALDI-TOFMS检测之前对酶进行了去除。该方式方法免标记、快速，合适于大量筛查酶活性。2.2、反响后产物标记法检测复杂样品如血液、细胞或组织中酶活性时，酶底物或产物的信号会被其他物质所干扰，因而开发对特定底物或产物进行分离富集以及选择性定量分析，并能够对多种酶进行同时分析的方式方法，对于酶活性评价和酶抑制剂挑选起着重要作用。Yang等[29]合成一种末端含有酰肼的氟化物探针，此探针与-葡萄糖苷酶水解后的糖反响，并通过与氟化金单分子层外表的氟互相作用而被固定，然后用MALDI-TOFMS进行检测并测定酶活性。采用此方式方法测定了两种酶抑制剂的IC50值，证明该方式方法适用于酶抑制剂的挑选。然而在蛋白激酶催化经过中，由于反响混合物中含有丰富的非磷酸化肽，会对磷酸化肽的信号产生，因而Lv等[30]在酶催化反响之后，利用自制的二氧化钛纳米颗粒填充的毛细管柱，从复杂混合物中分离富集磷酸化肽，提高其信号强度。通过合成与底物肽分子量类似的肽段作为内标，定量分析了磷酸化效率。通过测定临床治疗慢性骨髓白血病的一种药物(Abl的抑制剂)的IC50值，验证了MS方式方法的有效性。然后利用该方式方法挑选了实验室合成的6个该药物类似物，得到的结果与酶联法吻合。Deng等[31]开发了用于MALDI-TOFMS定量分析多种蛋白激酶活性的同位素二甲基标记底物的方式方法。采用稳定同位素二甲基标记法，在一个MALDI靶点上实现了在单个和多重底物体系中，对不同反响时间下蛋白激酶A(PKA)活性的监测。除此之外，通过完好的标记和精到准确的定量，能够准确得到动力学常数。该方式方法还成功地应用于激酶抑制剂的挑选。因而，该方式方法能够高通量、简单、快速、经济有效和准确地定量激酶和激酶抑制剂。Gregorius等[32]还提出了将金属标记肽用于多重酶活性测定。蛋白水解反响后，利用络合稀土金属离子使胰蛋白酶酶解反响后生成的剩余底物和肽产物构成金属螯合物进行标记。使用MALDI质谱对简单肽混合物进行定量，或使用LC-MALDI质谱对复杂底物混合物的标记肽进行定量，其准确度高，动态范围宽(至少2个数量级)，可用于监测随时间变化的产物构成和底物消耗经过。由于该方式方法具有多路复用能力和准确性，在生物化学和生物技术领域具有广泛的应用前景。图5DUB活性表征经过[28]Fig.5TheprocessofDUBactivitycharacterization[28]2.3、反响前底物标记法除了对酶与底物反响后的产物、剩余底物进行标记富集外，Ling等[33]报道了一种芘连接的底物肽，用于MALDI-TOFMS定量测定蛋白酶活性。该方式方法选择了一个序列为GGGGRG的胰蛋白酶特异性肽段与芘结合，构成了芘连接肽探针Py-GGGGRG。在胰蛋白酶存在下，Py-GGGGRG探针能够特异性水解成Py-GGGGR。芘的引入大大提高了肽段的电离效率，由于底物和产物的分子量类似，能够直接通过底物和产物的强度比例进行定量。并且利用芘的疏水性和共轭构造，用聚苯乙烯涂层的MAL-DI板可选择性地从复杂混合物中捕获芘肽段。该方式方法的线性范围宽，检出限低，已成功地用于尿液中胰蛋白酶活性的定量测定和胰蛋白酶抑制剂的挑选。除此之外，还利用探针Py-GGGGGGYG对糜蛋白酶进行了验证。该方式方法简单、高通量、定量准确，在多种蛋白酶活性测定和特定肽序列挑选抑制剂方面具有很大的应用潜力。众所周知，MALDI-TOFMS技术由于基质小分子干扰，在小分子区域酶底物或产物的测定方面遭到限制。Wang等[34]报道了一种蒽醌-谷胱甘肽(Aq-ECG)探针，利用MALDI-TOFMS快速定量分析谷氨酰基转肽酶(GGT)的活性(如此图6)。该探针是一种水溶性分子，由芳香蒽醌(Ag)和谷胱甘肽(ECG)通过一步硫醇-烯反响共价连接。蒽醌部分的作用不仅仅是在GGT催化裂解后提高目的离子的分子量，使目的离子出如今较高的m/z区域，避免基质离子的干扰，而且能显着提高肽的电离效率。除此之外，磁性氧化石墨烯能够选择性捕获蒽醌部分，将目的物与复杂混合物分离。使用一个蒽醌连接的甲基化谷胱甘肽作内标，能够定量分析GGT活性。利用该探针在健康人和肝癌病人血清样本中能检测到GGT，结果与酶联免疫吸附法测定结果一致。该方式方法还成功地应用于不同肿瘤、正常细胞内源性GGT含量的检测以及抗癌药物丁酸钠对GGT活性抑制作用的研究。利用该分子探针，开发了一种简单、灵敏、经济的方式方法，能够准确定量地测定GGT活性并挑选其抑制剂或抗癌药物。该方式方法可以改变探针部分，广泛应用于其他蛋白酶活性分析。图6Aq-ECG和Aq-ECA的合成道路(A)以及基于Aq-ECG的酶活性分析方式方法流程图(B)[34]Fig.6SyntheticroutesofAq-ECGandAq-ECA(A),andschematicflowchartofAq-ECGbasedmethodformonitoringenzymeactivity(B)[34]表1中对上述主要的方式方法进行归纳总结，列举了不同方式方法的基本原理、适用范围和优缺点。表1酶活性分析方式方法性能的比拟3、结论与瞻望综上所述，由于MALDI质谱的高通量、高耐盐性等优点使得其在酶活性分析和酶抑制剂挑选中具有独特的优势。与其他传统分析方式方法相比，MALDI质谱能够直接检测酶催化反响的底物和产物的分子量信息，并且十分适用于多种酶的同时分析，在定性和定量分析方面均有广泛的应用前景。然而MAL-DI-TOFMS的重现性较差，用小分子有机基质时，由于结晶不均匀，会导致响应差异。基于MALDI-TOFMS的酶活性分析还需要提高底物或产物的离子化效率以及重现性，以提高酶活性分析的灵敏度以及定量准确性。因而，开发更简单、快速、效率高的酶活性分析MALDI-TOFMS平台在临床检测中具有重要意义。以下为参考文献[1]Lopez-OtinC,MatrisianLM.Nat.Rev.Cancer,2007,7:800-808．[2]ThornberryNA,LazebnikY.Science,1998,281:1312-1316．[3]PuenteXS,SanchezLM,OverallCM,Lopez-OtinC.Nat.Rev.Genet.,2003,4:544-558．[4]LeungD,AbbenanteG,FairlieDP.J.Med.Chem.,2000,43:305-341．[5]HavaleSH,PalM.Bioorg.Med.Chem.,2018,17:1783-1802．[6]YanR,BienkowskiMJ,ShuckME,MiaoH,ToryMC,PauleyAM,BrashierJR,StratmanNC,MathewsWR,BuhlAE.Nature,1999,402:533-537．[7]FriedlP,WolfK.CancerRes.,2008,68:7247-7249．[8]HaimH,SalasI,SodroskiJ.J.Virol.,2020,87:1884-1889．[9]WuJ,FuZF,YanF,JuHX.TrAC,TrendsAnal.Chem.,2007,26:679-688．[10]CravattBF,WrightAT,KozarichJW.Annu.Rev.Biochem.,2008,77:383-414．[11]SoderstromCI,SpriggsFP,SongW,BurrellS.J.Immunol.Methods,2018,371:106-113．[12]XiaZY,XingY,SoMK,KohAL,SinclairR,RaoJH.Anal.Chem.,2008,80:8649-8655．[13]LathiaUS,OlgaO,VladimirB,MarkN.Anal.Biochem.,2018,398:93-98．[14]YanXW,YangLM,WangQQ.Angew.Chem.Int.Ed.,2018,50:5130-5133．[15]PercyAJ,ParkerCE,BorchersCH.Bioanalysis,2020,5:2837-2856．[16]JeongminJ,BoramL,TaehoL,Kwang-HyeonL.RapidCommun.MassSpectrom.,2021,28:2405-2414．[17]SuJ,MrksichM.Angew.Chem.Int.Ed.,2002,41:4715-4718．[18]MinDH,SuJ,MrksichM.Angew.Chem.Int.Ed.,2004,43:5973-5977．[19]KuoHY,DeLucaTA,MillerWM,MrksichM.Anal.Chem.,2020,85:10635-10642．[20]BanL,MrksichM.Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47:3396-3399．[21]KimJ,MrksichM.NucleicAcidsRes.,2018,38:e2．[22]ChoiI,KimDE,AhnJH,YeoWS.ColloidsSurf.B,2021,136:465-469．[23]HuJJ,LiuF,JuHX.Anal.Chem.,2021,87:4409-4414．[24]Sanchez-RuizA,SernaS,RuizN,Martin-LomasM,ReichardtNC.Angew.Chem.Int.E