流式细胞术的临床应用

流式细胞术

在血液系统疾病中应用深圳市血液病研究所李明

流式细胞仪(flowcytometer,FCM)：是对细胞等生物粒子的理、化及生物学特征（如大小、内部结构、DNA含量、细胞表面表达等）进行快速测量并分类收集的高技术。

其特点是：快速、灵活、大量、灵敏、可定量。流式细胞仪的组成四大部分：流路流动室样本流、鞘液之间压力平衡形成单细胞流动光路氩离子激光发射波长488nm，照射到经不同荧光染色处理的细胞上发射不同波长的荧光检测系统不同的光接收装置（探测器）分析系统计算机分析

PMTPMTPMTPMT4DichroicFiltersBandpassFiltersFlowCytometryPrincipleLaser1234FlowcellFlowCellInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluidPOWERFULMULTICOLORANALYSIS

流式细胞仪所检测的信号FS(前向散射光)：在发射光的前向所探测到的信号反映细胞大小SS(侧向散色光)：在发射光的侧向所探测到的信号反映细胞粒度、膜、核、胞质等FL（荧光)：荧光型号检测细胞表面标记、DNA含量等

荧光染料及其特性

细胞经不同荧光染料处理，可标记上不同的荧光，不同的荧光染料在相同的激发波长的激光激发下，具有不同的发射波长。

CoulterEPICSXL单激光4色荧光CoultterFC500单激光5色荧光CoultterNavous双激光10色荧光

常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色

ECD488620免疫荧光橙红PI488620DNA染色

橙红PeCy5488675免疫荧光深红免疫荧光分析

细胞表面的抗原（或细胞膜受体）与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物，通过流式细胞仪测定其荧光量，得到细胞群的不同抗原位点的表达情况。ImmunophenotypingCD2CD4CD#=clusterdesignationnumber

流式细胞仪与单克隆抗体技术相结合，可对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量，成为临床检验的一项重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将不同抗原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步去分各细胞亚群，这对于造血系统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估起了重要作用。

流式细胞仪参数分析

散点图

单参数直方图一维数据图形

双参数散点图显示两个独立参数与细胞定量的关系90DegreeScatter02004006008001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale

LogFITC

1000

100

10

1.1ImmunophenotypingHISTOGRAM单参数直方图LogFITCFluorescence(CD8).1

1

10

1001000123445%2%26%

双参数直方图DOTPLOT27%人类白细胞分化抗原

（clusterofdifferentiation，CD）

细胞表面抗原是在细胞分化中产生的，故称为分化抗原。

1982年巴黎首届人类白细胞分化抗原国际会议确定CD命名法，到目前为止已有200多个分化抗原被命名。常用CD抗原及其相关细胞群

细胞群CD抗原T细胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B细胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75髓细胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK细胞CD16CD56CD57CD94血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f内皮细胞CD105CD106CD109细胞因子RCD25CD115CD117CD122CD126流式细胞仪的临床应用

免疫学血液学肿瘤学药学细胞生物学

淋巴细胞免疫分型荧光染料标记的单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，结合多色荧光分析，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。淋巴细胞主要分为T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和NK细胞（CD16+56+）T淋巴细胞又分为T辅助细胞/T诱导细胞(Th/i)和T抑制细胞/T细胞毒细胞(Ti/Tc)Thelper/Tinducer（CD3+CD4+）

Tsuppressor/Tcytotoxic（CD3+CD8+）淋巴细胞免疫分型T淋巴细胞/B淋巴细胞/NK淋巴细胞及亚群分析T淋巴细胞亚群：CD3+，反映T细胞免疫功能。CD4+、CD8+下降：免疫缺陷、γ免疫球蛋白下降、胸腺发育不良。CD8+增高：病毒感染（HBV、CMV、EB）H/S比值是HIV感染病人的重要监测指标H/S比值升高：自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、SLE等。H/S比值降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血等。B淋巴细胞：CD19+，与体液免疫功能有关。B细胞减少：体液免疫功能受抑制B细胞增高：B细胞增殖性疾病(ALL、CLL、NHL、MM)双色荧光分析IsotypeControl(1/2a)：阴性对照CD3/CD19：T淋巴细胞和B淋巴细胞CD3/CD4：T辅助/诱导淋巴细胞CD3/CD8：T抑制/毒性淋巴细胞CD3/CD16+56：T淋巴细胞和NK淋巴细胞淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析流式细胞仪在血液学中的应用白血病及淋巴瘤免疫分型微小残留病检测

PNH诊断血小板功能检测干细胞移植白血病及淋巴瘤分型

根据白血病细胞病变时分化阻滞学说，认为白血病与正常细胞一样，可表达某一些系及某一发育阶段的抗原特征，对一个细胞而言，确定了这两种抗原组成，也就确定了细胞的系所属性及分化程度。免疫学分型是对白血病FAB分型的补充。但需要多单抗联合、综合分析、统一判定、动态观察。白血病免疫分型四大类急性淋巴细胞白血病（ALL）T淋巴细胞型白血病（T-ALL）B淋巴细胞型白血病（B-ALL）急性髓系细胞白血病（AML）混合性白血病未分化型白血病

AML与ALL免疫表型

CD10CD19CD22CD3CD5CD7CD13CD33MPOc/mc/mB-ALL+++------T-ALL---+++---AML------+++T-ALL表型特征

表型特征组别免疫亚型CD7CD5CD2CD1CyCD3SmCD3CD4CD8I幼稚胸腺细胞型

+-/+-/+-+/----II普通胸腺细胞型++++++/-++III成熟胸腺细胞型+++++/-++/-+/-

B-ALL亚型

免疫亚型DRCD19CD10CD22CD20CyIgMsmIgIg重排

I无标志型+-/+------

（null-ALL）

II普通型+++/+-/+--+

（common-ALL）

III前B细胞型++++++-+

（pre-B-ALL）

IVB细胞型+++/-++-++

AML免疫表型

M0

M1M2M3M4M5M6M7HLA-DR+++-+++/-+/-CD34+++/--+/-+/--+/-CD33+++++++/-+/-CD13++/-++++++/-CD11b--++/-++-/CD15+-++/-+++/-/CD14--+/--++--GPA------+-GP4