第四章细胞培养与代谢调控

1、细胞培养发展简史及有关概念

1907年，美国生物学家哈里森将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周，并观察了神经突起的生长现象。被称为“细胞（组织）培养之父”。

Carrel1912年提出无菌操作技术，1923年又设计了卡氏培养瓶。

现在，细胞培养技术已经成为现代医学研究中的一项重要的手段。近年来，细胞培养技术在细胞生物学、分子生物学、遗传学、药理学、免疫学、老年学、肿瘤学和病毒学以及临床各学科领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕成果。当前1页，总共45页。1）细胞培养（cellculture）

是指将组织取出后，用化学或物理的方法，将其分散成单个细胞在体外条件下进行培养。细胞在培养的过程中不再形成组织。培养物是单个细胞或细胞群。

从广义上讲，体外(invitro)培养包括所有结构层次的培养，即器官培养、组织培养和细胞培养。2)组织培养（tissueculture）

指从体内取出组织，在体外模拟体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。此时可能有组织分化并保持组织的结构与功能。培养物是组织碎块或器官的一部分。当前2页，总共45页。3）器官培养（organculture）

指器官的胚芽、整个器官在体外条件下的保存或生长，此时亦能有器官的分化并保持器官的立体结构和功能。

实际上，在体外培养时，无论采用什么方法和条件，培养的主要成份仍然是细胞。另外，细胞培养也并不意味着细胞彼此是独立的，细胞在培养中的生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存，呈现一定的“组织”特性。所以组织培养和细胞培养并无严格区别，常用作同义语使用。当前3页，总共45页。4）原代培养(primaryculture)

将机体取出的细胞或组织进行实效（立即）培养的过程，又称初培养。初培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。5）传代培养(passageculture)

指从原代培养的细胞继续转接培养，又称继代培养。当前4页，总共45页。6）细胞系（cellline）

由原代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群即成细胞系。此时细胞发生了遗传突变，染色体呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制特性。

目前常用的细胞系有：3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）；CHO（正常中国仓鼠卵巢细胞）；L（小鼠肿瘤细胞）；BHK（叙利亚仓鼠肾）；Hela（人宫颈癌细胞)7）细胞株（cellstrain）

原代培养细胞能顺利传代，且保持原来染色体的二倍体数量和接触抑制行为，把这种传代细胞称为细胞株。8）克隆（clone）

又称无性繁殖系或无性系，指由一个细胞或共同祖先通过有丝分裂所产生的遗传特性一致的细胞群或生物群，亦指DNA片段群当前5页，总共45页。二、细胞培养的操作方式根据细胞培养时营养成分添加以及培养液与细胞收集方式的不同，细胞培养有：分批式、流加式、半连续式、连续式和灌流式5种操作方式。当前6页，总共45页。1、分批式培养分批培养是指细胞和培养基一次性加入到培养容器或生物反应器内进行培养，在培养过程中培养液体积不变，不添加营养成分，待细胞增长和产物积累到适当时间，一次性收获细胞、产物和培养液的方法。特点：（1）操作简单，培养周期短。（2）直观反映细胞生长代谢过程。（3）可直接放大。缺点：不能控制底物浓度、细胞容易老化、生长周期短、效率低等当前7页，总共45页。2、流加式培养分批培养是指在分批培养过程中，间歇或连续地不加一种或多种营养成分的培养方法。与分批培养相比，其具有以下优点：（1）可根据细胞生长速率、营养消耗情况，保证合理、充足的营养。（2）可以减少产物反馈抑制，排除有害代谢产物积累带来的细胞损伤。细胞不易老化。（3）可以避免在分批培养终因一次投料过多造成的底物抑制等影响，改善培养液流体学性质。（4）可以延长指数生长期，从而提高细胞密度，延长细胞培养周期。产物浓度较高，又能实现连续收获。单一补料，反复补料。当前8页，总共45页。3、半连续式培养半连续式培养又称重复分批式培养或换液培养在细胞增长和产物形成过程中，每隔一段时间从中取出部分培养液或者细胞，剩余的细胞作为种子，再用新的培养液补足到原体积，是反应期内的总体积不变。每次稀释培养体积的1/2~3/4。特点：（1）细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续很长时间。（2）可进行多次收获。（3）操作简便，生产效率高。

当前9页，总共45页。4、连续式培养连续式培养是在细胞达最大浓度以前，以一定速度向反应器连续添加新鲜培养液，同时含有细胞的培养液以相同速度连续从反应器流出，以保持培养体积恒定的培养方式。特点：（1）细胞能在恒定状态下生长，营养物质浓度、产物浓度、pH基本卡保持恒定细胞浓度以及生长速率可基本维持不变，细胞维持持续指数生长。（2）稳定状态可有效地延长分批培养中的对数生长期。

当前10页，总共45页。5、灌流式培养灌流式培养是指把细胞和培养基一起加入生物反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地取出部分培养液，同时又连续不断地补充新的培养液。与连续式操作的不知处在于取出培养液时，细胞均保留在生物反应器内。特点：（1）细胞截留系统可使细胞保留在生物反应器内，维持较高的细胞浓度。（2）能使细胞处在较稳定的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低。（3）反应速率容易控制，培养周期长，可提高生产效率，目标产品回收率高。（4）产品在反应器内停留时间短，可及时回收，有利于保护产品的活性。当前11页，总共45页。三、细胞培养动力学细胞培养动力学（dynamicsofcellcultivation）：是研究细胞生长、基质消耗以及产物生成规律的科学，包括细胞生长动力学、基质消耗动力学以及产物生成动力学。当前12页，总共45页。分批培养生长动力学在分批培养过程中，细胞生长过程主要包括：延迟（适应）期、指数生长期、减速期、平台期和衰退期5个阶段当前13页，总共45页。延迟期当前14页，总共45页。指数生长期当前15页，总共45页。减速期S:限制性基质浓度Ks:饱和常数μ:比生长速率μm:最大比生长速率当前16页，总共45页。平台期Xm:最大细胞浓度;Xo:接种时的细胞浓度So:限制性基质接种时的浓度;μm:最大比生长速率K:常数当前17页，总共45页。四、细胞代谢与调控代谢产物关系糖类代谢与脂肪代谢之间的关系，糖类与蛋白质代谢之间的关系，脂肪代谢与蛋白质代谢之间的关系，核酸代谢与糖、脂肪、蛋白质三者之间的关系代谢工程逆代谢工程当前18页，总共45页。生物大分子：糖、脂类、蛋白质蛋白质和脂类代谢取决于糖代谢的程度第二节物质代谢的相互关系TCA：糖、脂肪和蛋白质三大物质互相转化的枢纽物质代谢---联系---转化关键代谢物：如G-6-P，丙酮酸、乙酰辅酶A3/15/202319当前19页，总共45页。一、糖代谢与蛋白质代谢的相互关系1）蛋白质→AA，生糖AA→α-酮酸→糖（多数）AA脱氨→丙酮酸→糖异生→糖3/15/202320当前20页，总共45页。2）糖→非必需AA，但不能合成必需AA糖代谢：为Pr合成提供碳源和能源3/15/202321当前21页，总共45页。2、糖代谢与脂类代谢的关系饥饿：与糖尿病类似的情况3/15/202322当前22页，总共45页。3、脂类代谢与蛋白质代谢的关系脂类分解产生较多的能量→体内贮藏能量的物质脂类与蛋白质之间可以相互转化3/15/202323当前23页，总共45页。4、核酸代谢与糖、脂肪及蛋白质代谢的关系Gly、Asp、Gln嘌呤、嘧啶AMP辅酶、组氨酸等蛋白酶核苷酸、核酸的合成一碳基团核苷酸、核酸的合成3/15/202324当前24页，总共45页。酮体CO2尿素3/15/202325当前25页，总共45页。大分子降解成基本结构单位（构造单元）构造单元形成共同的中间产物（如丙酮酸、乙酰CoA等），产生NADPH、ATP中间物进入TCA,彻底氧化H2O、CO2，产生大量ATP3/15/202326当前26页，总共45页。第三节、代谢调控总论代谢调节的三级水平：细胞/酶水平调节激素水平调节神经水平调节多细胞整体水平调节代谢物通过影响细胞内酶活力和酶合成量的变化，改变合成或分解代谢过程的速度内分泌腺所分泌的激素通过体液输送到一定组织，作用于靶细胞，改变酶活性而调节代谢反应的方向和速度。CNS的控制下，通过神经递质对效应器发生直接影响，或者改变激素的分泌。3/15/202327当前27页，总共45页。一、酶水平的调节酶水平调节酶活性调节（酶结构调节）变（别）构调节快速调节（微调）酶合成的诱导与阻遏

长期调节（粗调节）酶含量调节（基因表达水平调节）化学修饰调节酶的降解（一）酶活力的调节3/15/202328当前28页，总共45页。别构效应物别构激活剂——别构激活（正反馈）——增加活性别构抑制剂——别构抑制（负反馈）——降低活性底物、产物或ATP、ADP、AMP等1反馈抑制：限速酶受其代谢体系终产物的抑制。3/15/202329当前29页，总共45页。3/15/202330当前30页，总共45页。代谢物别构中心活性中心反馈调节中酶活性调节的机制3/15/202331当前31页，总共45页。氨基酸合成的反馈调控反硝化作用氧化亚氮氨甲酰磷酸分支酸脱氧庚酮糖酸-7-磷酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸赤藓糖-4-磷酸脱氢奎尼酸莽草酸谷氨酸磷酸烯醇式丙酮酸+预苯酸TryPheTrpIleTrpHisCTPAMPGlnLysMetThr酮丁酸GlyAla谷氨酰胺合酶天冬氨酰半醛高丝氨酸氨基苯甲酸协同反馈抑制顺序反馈抑制3/15/202332当前32页，总共45页。2、产能反应与需能反应的调节细胞能量状态指标0.85～0.95能荷<0.85，产能（分解）代谢加强能荷＞0.95，贮能（合成）代谢加强糖原葡萄糖CO2＋H2O＋ATP321ATP、ADP、AMP也是一种变构剂3/15/202333当前33页，总共45页。丙酮酸

G细胞液柠檬酸乙酰CoA柠檬酸草酰乙酸-酮戊二酸乙酰CoA丙酮酸线粒体

G-6-PF-6-PF-1.6-2P

磷酸果糖激酶PEPADP+PiATPADP+PiATP

NADH

O2ATPADP+PiAMP+ATP2ADPPiPiPEP羧激酶+++---++----

己糖激酶

丙酮酸脱氢酶

柠檬酸合成酶-酮戊二酸

脱氢酶糖酵解与TCA途径的调节3/15/202334当前34页，总共45页。3、酶的共价修饰和级联系统（1）共价修饰（covalentmodification）：

酶蛋白肽链上的基团在另一些酶的催化下可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，这种改变酶活性的调节方式～（2）共价修饰的类型：磷酸化/去磷酸化（最常见），乙酰化/去乙酰化腺苷酰化/去腺苷酰化，尿苷酰化/去尿苷酰化甲基化/去甲基化，氧化（S-S）/还原(2SH)3/15/202335当前35页，总共45页。3/15/202336当前36页，总共45页。（3）特点

修饰过程，酶活性在无活性（低活性）与有活性（高活性）两种状态中互变共价修饰互变由不同的酶催化快速调节激素信号启动的共价修饰会引起级联放大效应3/15/202337当前37页，总共45页。糖原磷酸化酶和糖原合成酶活性的调节3/15/202338当前38页，总共45页。受共价修饰调节的酶酶来源改变反应对酶活力的影响糖原磷酸化酶真核细胞磷酸化/脱磷酸化+/-磷酸化酶b激酶哺乳类磷酸化/脱磷酸化+/-糖原合成酶真核细胞磷酸化/脱磷酸化-/+丙酮酸脱氢酶真核细胞磷酸化/脱磷酸化-/+谷氨酰胺合成酶原核细胞(大肠杆菌)腺苷酰化/脱腺苷酰化