番茄酱中番茄红素和β-胡萝卜素

-.z.番茄酱中番茄红素和β—胡萝卜素的提取别离及分析测定一、实验目的

1、理解有机溶剂提取番茄红素和β—胡萝卜素的方法及原理

2、掌握萃取别离过程的根本操作

3、掌握层析柱的操作

4、掌握分光光度法的测定色素含量的方法

5、掌握实验数据的处理及色素含量的计算方法二、实验原理

番茄酱浓缩了番茄中的番茄红素和β-胡萝卜素，二者的构造均属于类胡萝卜素。因而在构造上极为相似。番茄红素构造化学式如下：β-胡萝卜素构造化学式如下：类胡萝卜素为多烯类色素，不溶于水而溶于脂溶性有机溶剂。本实验先用较高极性的溶剂提取较高极性的色素，同时脱去样品中的存在的少量水分；再用较低极性的溶剂补充提取较低极性的色素。因为低极性溶剂不与水混溶，故先除去水分后才能有效地从组织中较完全地萃取类胡萝卜素。根据番茄红素与β-胡萝卜素极性的差异，用柱层析可以将它们别离。

番茄红素在不同的有机溶剂里均有类似的吸收峰,最大吸收峰的波长在500nm附近，将别离后的样品溶解在适当的溶剂中,在最大吸收峰处用分光光度计测定溶液的吸光度；番茄红素标准品价格昂贵,且本身稳定性差,不宜长期保存。根据苏丹红〔Ⅰ〕在500nm附近和番茄红素、β-胡萝卜素具有一样的吸收特性，以苏丹红代替番茄红素作为标准品，用氯仿作为溶剂及参比液，在500nm附近测定苏丹红的系列吸光度，绘制标准曲线；用番茄红素的提取液的吸光度值在此标准曲线上查取相应浓度，以此来表征番茄红素的浓度。通过换算得到番茄酱中该色素的含量。

β-胡萝卜素的含量采用色价的测定及计算方法。色价是色素在商业上的浓度计量方式，定义为单位质量原料的提取物在1％浓度、以1cm比色皿在其最大吸收峰处的吸光度。色价的特点是不需要校准样，也不需作标准曲线，简单快速。具体操作是取样品m克，在天平上准确称重，用Vml石油醚溶解，以石油醚作参比液，在λma*下测量样品溶液的吸光度A，样品色价E按下式计算：三、物理常数名称分子式相对分子质量外观熔点

℃溶解度最大吸收波长λ水乙醇氯仿石油醚番茄红素536.88针状深红色晶体174不溶微溶可溶可溶485～500nmβ-胡萝卜素536.88紫红或暗红色结晶或结晶性粉末176～182不溶微溶可溶可溶480nm四、试剂和仪器

1、试剂及原料

亨氏番茄酱、95%乙醇〔C.P〕、二氯甲烷〔C.P〕、石油醚〔60-90℃〕、氯仿〔A.R〕、中性氧化铝〔C.P〕、氯化钠〔C.P〕、无水硫酸钠〔C.P〕、苏丹红Ⅰ〔C.P〕2、仪器

回流装置、恒温磁力搅拌器、层析柱(15cm左右内径为1-1.2cm)、分析天平,移液管、容量瓶、VIS-7220分光光度计五、实验步骤

1、混合色素的提取

称取新鲜番茄浆[1]10g于50ml枯燥的圆底烧瓶中，加极性的试剂(建议用95%乙醇)［A］20ml，摇匀，装上回流冷凝管及恒温磁力搅拌器，在相应温度的水浴中加热，回流5分钟，冷却后抽滤，滤液直接进入一个的50ml锥形瓶中。残渣转入原50ml圆底烧瓶中瓶内，参加15ml低极性溶剂(建议用二氯甲烷)［A］，在相应温度的水浴上回流5分钟，冷却，混合物常压过滤，滤液直接滤入以上50ml锥形瓶中，再加5ml低极性溶剂洗涤残渣，过滤。合并高极性提取液和两次低极性提取液，倒入100ml分液漏斗中，加4ml饱和氯化钠溶液[2]，振荡萃取，静置分层。分出较深色有机相后，使其流经一个在颈部装有疏松棉花且在棉花上铺有6g无水硫酸钠的漏斗，以除去其中的微量水份。再用5ml低极性溶剂洗涤枯燥剂，合并枯燥后所得的溶液于一枯燥的50ml圆底烧瓶中。水浴蒸馏溶液，蒸出大局部溶剂后，在通风橱内直接水浴加热圆底烧瓶[3]，并用洗耳球不断向圆底烧瓶吹气,直到完全蒸干为止备用。

2、层析柱的制备

取一支长15cm左右内径为1-1.2cm的枯燥的层析柱，将其垂直固定于铁架上，底部铺上少量棉花，翻开活塞。称取8g氧化铝小心倾入层析柱中，在氧化铝上铺一层棉花[4]。然后向柱内参加15ml石油醚，让溶剂浸润并流过层析柱，注意柱顶部溶剂不能干涸。待溶剂液面刚好与氧化铝外表相切时，关闭活塞，备用。3、柱层析别离

向蒸干的粗样品中参加2ml苯使其溶解。用一长颈滴管取样，小心滴入层析柱内，注意产品不能接触柱壁[5]。翻开活塞，让溶液自然流下，待液面刚好与柱顶氧化铝外表相切时，参加2ml石油醚，用50ml枯燥的锥形瓶[6]接收滴出的溶液。待溶剂液面与氧化铝外表相切时，再参加8ml或更多的石油醚，至滴出的溶液无色，关闭活塞，收集黄色的β-胡萝卜素溶液(a)；翻开活塞，再往层析柱中先后参加2ml及8ml的氯仿，洗至滴出的溶液无色，用另一50ml枯燥的锥形瓶[6]接收，关闭活塞，收集溶液红色的番茄红素〔b〕。然后用相应温度的水浴蒸干(a)、(b)，差重法分别称出相应浓缩物的重量Wa、Wb(准确到0.0002)。

4、苏丹红(Ⅰ)工作曲线

用分析天平准确称取约5.0mg苏丹红(Ⅰ)于小烧杯中，参加少量溶剂(建议用氯仿)［B］在通风橱内水浴加热搅拌溶解，待溶液冷却至室温后全部转移到100ml的容量瓶中，用溶剂(建议用氯仿)稀释定容至刻度线，可得到50μg/ml的标准液。然后用10ml的移液管分别移取该溶液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于五个25ml的容量瓶中，然后参加溶剂将其稀释定容至刻度，它们浓度分别为4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、20μg/ml。用该溶剂作参比溶液，在波长为510nm下分别测其吸光度，以吸光度对浓度作图，可得到吸光度对浓度的标准工作曲线图及关系式。

5、番茄红素及β-胡萝卜素含量的测定［D］

5.1、番茄红素含量的测定及百分含量的计算

往蒸干〔b〕所得的浓缩物中参加5ml的氯仿溶解，此溶液的浓度为C1；用1ml移液管移取0.5ml该溶液于25ml锥形瓶中，用定量的氯仿分步稀释该溶液，使溶液的颜色与吸光度为0.5左右的苏丹红(Ⅰ)溶液的颜色接近，此时溶液的浓度为C2［7］。在400-600nm区间测定番茄红素最大吸收波长λma*，在此λma*下测其吸光度［C］。将该吸光度值代入标准工作曲线，求出其浓度C2，从而推算出番茄酱中番茄红素的含量。

其中：f是C1稀释到C2倍数；各值的单位：C2：μg/ml;W番茄酱：g.

5.2、β-胡萝卜素含量的测定及色价的计算［D］

用5ml石油醚作溶剂溶解(a)的浓缩物，取出１ml，再用石油醚稀释3-5倍，使其吸光度值落在0.3-0.7的范围内。然后以石油醚作参比溶液,在480nm测其吸光度。由色价公式算出稀释后的浓缩物中β-胡萝卜素的色价，从而推算出样品番茄酱中β-胡萝卜素的色价。色价计算公式：

E：稀释后浓缩物的色价、A：吸光度、V：稀释浓缩物所用石油醚的总体积(ml)、m：浓缩物〔b〕的质量Wb(g)

番茄酱中β-胡萝卜素的色价计算公式：

m稀释后浓缩物E稀释后浓缩物

=

m番茄酱E番茄酱实验探究局部(下划线局部为实验探究内容，可以选择不同条件)

［A］、较高极性溶剂可选择:95%乙醇〔C.P〕，丙酮〔C.P〕，甲醇〔C.P〕；较低极性溶剂可选择：二氯甲烷〔C.P〕、乙醚〔C.P〕，石油醚〔C.P〕〔30-60℃〕

［B］、溶解苏丹红的溶剂选择：氯仿，甲苯，石油醚。选择条件参考物理常数表中

［C］、波长位点选择：根据实验测定番茄红素、β-胡萝卜素吸光度的最大波长来选择测定时的λma*

［D］、含量的数据处理方法的选择：科研中常用的使用标准样的百分含量计算法；商业中常用的不使用校准样的色价计算法。注释

[1]、番茄酱采用"亨氏番茄酱〞.称取番茄酱时，可直接用大口胶头滴管从瓶里吸取番茄酱参加到圆底烧瓶底。

[2]、饱和氯化钠可防止乳化并有利于分层.

[3]、进展该操作时，边振荡边拿着洗耳球向瓶中吹气，有利于加速蒸干溶剂。

[4]、棉花的作用是防止氧化铝被倾入的溶剂冲散，从而保证氧化铝外表的平整。

[5]、使层析中各成分能同步流出。

[6]、称空锥形瓶的重量,以备用差重法计算产物重量：m稀释后浓缩物E稀释后浓缩物

=

m番茄酱E番茄酱

[7]、颜色深浅与吸光度的大小有对应关系，故相近颜色表相近的吸光度。从而根据溶液的吸光度