川芎多糖除蛋白方法研究

川芎多糖除蛋白方法研究方升平，王维香，雒小龙【内容摘要】目的对川芎多糖进行除蛋白处理，挑选最佳除蛋白方法。方法采取sevag法、三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法3种方法对川芎多糖进行除蛋白处理，通过比较不同方法处理后的蛋白含量及多糖含量来确定最佳的除蛋白方法。结果sevag法的蛋白质去除率高(90%以上)，但多糖回收率仅为40%;三氯乙酸法的蛋白质去除率为37.28%，多糖回收率为73.19%;三氯乙酸-正丁醇法的蛋白质去除率为83.60%，多糖回收率为85.16%，且操作快速、简便。结论三氯乙酸-正丁醇法除蛋白效果较好。【本文关键词语】川芎;多糖;除蛋白川芎为〔中国药典〕2005年版(i部)收载品种，为伞形科植物川芎ligusticumchuanxionghort.的枯燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的成效，常用于治疗月经不调，经闭痛经，症瘕腹痛，胸胁刺痛，跌扑肿痛，头痛，风湿痹痛[1]。川芎含有内酯类、生物碱类、酚类、以及挥发油类等多种化合物，对其多糖的研究也逐步遭到看重[2,3]。鉴于多糖是构成生命的基本物质之一，具有多种生理活性[4]，对川芎多糖的研究就显得尤为需要。系统研究川芎中多糖物质，说明其生物活性，为开发高技术含量的川芎多糖保健食品和药物提供理论基础。其中，川芎多糖分离纯化是首要和关键的步骤，多糖纯度的高低直接影响后续的性质、构造分析、药理活性以及构效关系研究的精确性。在多糖提取液中[5～7]，蛋白质却占了很大的比例，因而，怎样尽量多去除蛋白质而保留多糖的有效成分是一个具有主要意义的课题。多糖中蛋白质的去除方法有多种，包含sevage法[8]、三氯乙酸法[8]、蛋白酶法[9]、盐酸法[8]等。不同的方法适用不同来源的多糖，要详细探索，实验中常采取几种方法联合除蛋白。当前尚未见到去除川芎多糖中蛋白质的研究报道，本实验对川芎多糖粗提液中蛋白质的去除方法进行了初步讨论。1材料与仪器川芎购于成都中药材市场，经本学院制药工程系唐灿博士鉴定为伞形科多年生草本植物川芎ligusticumchuanxionghort.的枯燥根茎，枯燥粉碎，过40目筛，待用;葡萄糖、硫酸、蒽酮、三氯乙酸、正丁醇(均为分析纯，成都金山化学试剂)。uv-2600型紫外分光光度计(上海光谱仪器)，hh-s数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)，re-52b旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，电子天平bs200s(北京塞多利天平)。2方法2.1样品制备称取适量粉碎过筛的川芎粉末，经石油醚索氏抽提脱脂后风干，参加10倍蒸馏水，搅匀，100℃提取2h，离心取上清液，滤渣则以同样条件反复提取2次，合并3次提取液，旋转蒸发浓缩至1∶10(1g川芎粉末∶10ml提取液)。2.2多糖测定方法采取蒽酮-硫酸法[5]工作曲线方程为：y=0.1652x-0.001(r2=0.9994)。y：葡萄糖浓度(mg/ml);x：吸光度。2.3蛋白质含量测定紫外吸收直接测定法[10]在紫外分光光度计上，以生理盐水为对照，测得待测溶液在280nm和260nm两种波长的吸光度(a280nm及a260nm)。将a280nm和a260nm波优点测得的吸光度按以下公式计算蛋白质的浓度。c=1.45a280nm-0.74a260nm式中c：蛋白质浓度(mg/ml);a280nm：溶液在280nm处测得的吸光度;a260nm：溶液在260nm处测得的吸光度。2.4除蛋白方法2.4.1sevag法取25ml浓缩糖液，将氯仿按浓缩液1/5体积参加，随之再参加氯仿体积1/5的正丁醇，混合物剧烈振荡30min，分出水层和有机层接壤处的变性蛋白质。反复上述操作，直至无变性蛋白质出现。测定上清液的多糖浓度和蛋白质浓度。2.4.2三氯乙酸法取25ml浓缩糖液，参加适量的2mol/l三氯乙酸溶液，混合器上振荡混合均匀后4℃下静置过夜，离心弃去沉淀，采集上清液，测定多糖浓度和蛋白质浓度。2.4.3三氯乙酸-正丁醇法取25ml浓缩糖液，参加适量的三氯乙酸与正丁醇的混合液于混和振荡器上混合均匀，4℃下静置一段时间，离心弃去沉淀，采集上清液，测定多糖浓度和蛋白质浓度。3结果3.1sevag法除蛋白效果反复sevag法操作11次，无变性蛋白质出现(蛋白质去除率在90%以上)，多糖回收率仅为40%。3.2三氯乙酸法除蛋白效果3.2.1三氯乙酸溶液的用量对除蛋白效果的影响由图1能够看出，随着三氯乙酸用量的增大，除蛋白效果加强，同时多糖的损失率也逐步增长。但三氯乙酸的体积跨越多糖液体积的7%时，多糖的损失加剧，而蛋白去除率增长缓慢。故三氯乙酸溶液合理用量为多糖体积的7%，此时蛋白去除率为26.28%，多糖回收率为65.79%。图1三氯乙酸溶液的用量对多糖溶液中蛋白质及多糖含量的影响3.2.2振荡时间对除蛋白效果的影响由图2能够看出，随着振荡时间的增大，除蛋白效果加强，同时多糖的损失率也逐步增长，但振荡时间为25min时，多糖损失率和蛋白去除率到达稳定。故合理的振荡时间应为25min。综上所述，三氯乙酸法除蛋白最佳条件为三氯乙酸用量为多糖体积的7%，振荡25min。在最佳条件下蛋白质去除率为37.28%，多糖回收率为73.19%。图2振荡时间对多糖溶液中蛋白质及多糖含量的影响3.3三氯乙酸-正丁醇除蛋白效果在单因素实验基础上，选取三氯乙酸溶液与正丁醇的体积比、样品与三氯乙酸/正丁醇的体积比、振荡时间、静置时间4个因素，水平见表1，以蛋白质去除率和多糖回收率为指标，根据表1做l9(34)正交实验，结果见表2。表1三氯乙酸-正丁醇法除蛋白因素水平表2三氯乙酸-正丁醇脱蛋白l9(34)正交实验由表2可知，三氯乙酸-正丁醇法对蛋白去除率中各因素影响的主次顺序为bdac，即样品与三氯乙酸/正丁醇的体积比振荡时间三氯乙酸与正丁醇体积比静置时间。最佳结果为a2b1c3d1，即三氯乙酸与正丁醇的体积比为1∶5，样品与三氯乙酸/正丁醇的体积比1∶1，振荡1min，静置1h。上述正交实验中1～9号实验的多糖回收率分别为：81.58%，80.10%，78.79%，78.01%，84.60%，80.37%，77.61%，81.64%，57.96%。同法正交实验直观分析表示清楚：多糖回收率中各因素的影响主次顺序为，bcad即样品与三氯乙酸/正丁醇的体积比静置时间三氯乙酸与正丁醇的体积比振荡时间。最佳结果为a1b2c1d3。4个因素中，影响多糖含量和蛋白去除率的重要因素是样品与三氯乙酸/正丁醇的体积比。分别根据蛋白去除率的最佳组合，多糖回收率的最佳组合以及正交实验中蛋白去除率最高的4号实验。即a2b1c3d1，a1b2c1d3，a2b1c2d3反复实验，测得多糖回收率和蛋白去除率如表3。表3正交实验验证由表3可知，a2b1c3d1多糖回收率和蛋白去除率均最高，与正交实验基本吻合。即除蛋白的最佳条件为：三氯乙酸与正丁醇的体积比为1∶5，样品与三氯乙酸/正丁醇的体积比1∶1，振荡1min，静置1h，在这里条件下，蛋白的去除率高达83.60%，多糖的回收率为85.16%。4讨论sevag法根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点到达去除蛋白质的目的，是一种传统的除蛋白方法。由于sevag法需要反复操作，不仅造成多糖的损失严重，而且浪费大量试剂，增长了实验成本。当溶液的ph低于等电点时，蛋白质分子以阳离子形式存在，易于生物碱试剂(如苦味酸、鞣酸、磷钨酸、磷钼酸及三氯乙酸等)作用，生成不溶性盐沉淀，并伴随蛋白质变性。实验室中常用这些试剂定性检验蛋白质或去除杂蛋白。本实验中三氯乙酸除蛋白未造成多糖的明显损失，多糖回收率为73.19%，但蛋白去除率较差，在最佳条件下蛋白质的去除率仅为37.28%。实验证明三氯乙酸法不合适去除川芎多糖溶液中的蛋白质。三氯乙酸-正丁醇法把有机溶剂的变性作用和三氯乙酸的沉淀作用结合起来，能有效去除蛋白质，而且多糖损失率很低，是一种简单有效的方法，在最佳条件下蛋白去除率一次性高达83.60%，多糖的回收率为85.16%。多糖溶液中仍含有少量蛋白质，可能是这部分蛋白质和多糖结合构成糖蛋白，如需获得纯多糖制品，还需经过其他一系列提纯工序。也有报道用三氯乙酸-正丁醇法去除其他多糖中的蛋白质，如姬松茸多糖[11]、马齿苋多糖[12]、石花多糖[13]，蛋白质去除率在50%～90%之间，川芎多糖的蛋白质去除率为83.60%，表示清楚三氯乙酸-正丁醇法是比较有效的去除蛋白质的方法。【以下为参考文献】[1]杨丽红,谢秀琼,万丽,等.川芎化学成分研究[j].时珍国医国药,2007,18(7):1576.[2]范智超,张志琪.川芎多糖的提取、纯化及抗氧化活性的研究[j].天然产品研究与开发,2005,11:561.[3]jiang-fengyuan,zhi-qizhang,zhi-chaofan,etal.antioxidanteffectsandcytotoxicityofthreepurifiedpolysaccharidesfromligusticumchuanxionghort[j].carbohydratepolymers,2008,74:822.[4]chum,qixx,zhuf,etal.reviewofpolysacchariges[j].researchandinformationonchinesetraditionalmedicinea，2003,5(4):18.[5]唐崎,王维香,王晓君.碱法提取川芎多糖的研究[j].时珍国医国药,2008,19(9):2096.[6]李玲,王维香,王晓君.果胶酶法提取川芎多糖工艺的研究[j].中药材,2008,31(4):600.[7]向鸣,王维香,王晓君.超声波提取川芎多糖的工艺优选[j].中成药,2008,30(11):1621.[8]董英,张艳芳,孙艳辉.水飞蓟粗多糖脱蛋白方法的比较[j].食品科学,2007,28(12):82.[9]闫巧娟,韩鲁佳,江正强.酶法脱出黄芪多糖中的蛋白质[j].食品科技,2004,6:23.[10]陈钧辉.生物化学实验，第3版[m].北京：科学出版社,2002:61.[11]王丽华,李元瑞,陈懿,等.姬松茸多糖脱蛋白方法研究[j].食品科技,2003,1:18.[12]曲晓兰,昊从平,曹亮堂.马齿苋多糖脱蛋白工艺的研究[j]