海带多糖的体外抗氧化活性研究

海带多糖的体外抗氧化活性研究周娟，吴宏，刘青，捷明【内容摘要】目的研究海带多糖体外抗氧化作用。方法采取体外实验研究海带多糖对羟自在基、超氧阴离子的去除作用以及对h2o2诱导的红细胞氧化溶血和大鼠肝匀浆脂质过氧化的保卫作用。结果海带多糖体外可去除o-2·及·oh;抑制h2o2诱导的大鼠红细胞氧化性溶血;抑制小鼠组织mda的生成。结论海带多糖体外具有去除自在基及抗脂质过氧化的作用。【本文关键词语】海带多糖;氧自在基;脂质过氧化;抗氧化abstract:objectivetostudytheantioxidativeactivitiesoflaminarininvitro.methodstheantioxidantcapacityoflaminarinwasinvestigatedbyinvitroassay.thescavengingeffectoflaminarinonoxygenradicalsanditsinhibitoryeffectonlipidperoxidationwerestudied.inaddition,inhibitingeffectoflaminarinonh2o2inducedhemolysisofraterythrocyteswasstudiedaswell.resultslaminarinexhibitedadosedependentinhibitoryeffectonthehydroxylfreeradicalandsuperoxideanionfreeradical.italsoshowedsubstantialantioxidantactivityinhomogenatesofthemiceliverandheartinadosedependentmanner.theautohaemolysisofmiceredbloodcellswasblockedbylaminarininadosedependentmanner.conclusionlaminarinshowsantioxidantactivityinexperimentsinvitro.keywords:laminarin;oxygenradical;lipidperoxide;antioxidation海带属海带目海带科，含有多种生物活性成分，其大部分生物活性与其中的多糖成分亲密相关[1]。海带多糖(laminarin)是从海带中提取出来的多糖类化合物。梁桂林[2]等对海带多糖进行体内抗氧化研究，结果表示清楚海带多糖在体内具有抗氧化活性。本文对海带多糖的体外抗氧化作用进行了讨论。1材料与方法1.1材料海带多糖的提取、纯化及纸层析鉴定法按文献[3]制备。将市售干海带适度粉碎,用蒸馏水浸泡,加热提取,冷却离心,浓缩,浓缩液参加4倍体积的95%乙醇沉淀,沉淀物依次用无水乙醇、丙酮及乙醚洗涤,用蒸馏水复溶,透析,seveg法除蛋白,惯例枯燥得海带多糖。纸层析分析表示清楚,海带多糖由葡萄糖、半乳糖、木糖等构成。硫酸-苯酚法测多糖含量为85%，考马司亮蓝法测定总蛋白含量。硫代巴比妥酸购自国药集团化学试剂(批号：20080925);肝素为万邦医药(批号：0812111);抗坏血酸为福州海王福药制药产品(批号：0901042);硫酸亚铁、过氧化氢、三氯乙酸等均为市售分析纯试剂。752n紫外分光光度计(上海精致细密科学仪器);tdl60b台式离心机(上海安亭科学仪器厂);bs124s分析天平(北京赛多利斯仪器系统);hhs数显恒温水浴锅(常州市国立试验设备研究所);xhc旋涡混合器(常州市国立试验设备研究所)。实验动物为昆明种清洁级小鼠10只，体质量18～22g，雌雄各半，由福州海王福药制药提供，答应证号：scxk(闽)20050003。1.2方法1.2.1海带多糖去除·oh效果的测定根据smirnoff等的方法改良[4]，用feso4+h2o2产生·oh，以·oh氧化水杨酸所得产品的吸光值表示·oh的多少，吸光值越大，·oh越多。4ml反应体系中含9mmol/lfeso41ml，8.8mmol/lh2o21ml，9mmol/l水杨酸1ml(用50%乙醇作溶剂)及1ml不同浓度的海带多糖，最后加h2o2启动反应，37℃温浴1h，于510nm测吸光值。空白组以重蒸水代替水杨酸和海带多糖，对照组以重蒸水代替海带多糖。去除率以[a0-(ai-ai0)]/a0×100%计算，其中a0为对照，ai为海带多糖某浓度时的吸光值，ai0为空白组的吸光值。1.2.2海带多糖去除o-2效果的测定[5]每支试管加trishcl缓冲液(ph8.2)4.5ml，25℃预热20min，加1ml不同浓度的海带多糖，再加10mmol/l的邻苯三酚0.4ml，立即摇匀，精确反应4min，立即参加8mol/lhcl0.1ml终止反应，325nm测吸光值。空白组以重蒸水代替邻苯三酚和海带多糖，对照组以重蒸水代替海带多糖。去除率以(a0-ai)/(a0-ai0)×100%计算，其中a0为对照，ai为海带多糖某浓度时的吸光值，ai0为空白组的吸光值。1.2.3海带多糖对小鼠红细胞h2o2所致溶血的影响[6]小鼠颈总动脉采血，肝素抗凝，4℃3000×g离心得红细胞，冷生理盐水洗3次，制成0.5%悬浮液。取红细胞悬液1ml,加不同浓度的海带多糖，最后加50mmol/lh2o20.5ml混匀，37℃温浴1h，加生理盐水4ml，3000r/min离心5min，取上清于415nm测定其吸光值。正常组以生理盐水代替h2o2和海带多糖，模型组以生理盐水代替海带多糖。以模型组为100%溶血，计算溶血度及抑制率。1.2.4海带多糖对生成mda抑制造用的测定小鼠颈椎脱臼致死，迅速分离出肝组织和心组织，用冷的生理盐水洗净后称重，冰浴下匀浆，制成含蛋白质0.5%的悬浮液。取5%肝/心匀浆悬浮液0.2ml，参加不同浓度海带多糖溶液1ml，在37℃温浴1h后，参加20%tca1ml终止反应,再加0.67%tba1ml，于沸水浴中显色15min，冷却后离心，测532nm上清液吸光度，以吸光度表示mda含量的多少。对照组以重蒸水代替海带多糖，去除率以(a0-ai)/a0×100%计算，其中为a0为对照，ai为海带多糖某浓度时的吸光值。1.2.5海带多糖对fe2+h2o2诱导的小鼠肝线粒体中mda生成的影响肝组织于在冰浴下以生理盐水制成10%匀浆，2000r/min离心20min，取上清液，以10000×g离心20min,沉淀用生理盐水洗涤2次后,以生理盐水配成吸光值在0.5～0.6的线粒体悬浮液[7]。取肝线粒体悬浮液2.5ml，参加不同浓度海带多糖溶液0.4ml，再参加1mmol/lfeso40.1ml，1mmol/lh2o20.1ml，在37℃温浴1h后，取0.1ml温育后的各管溶液，参加20%tca1ml终止反应，再加0.67%tba1ml，于沸水浴中显色15min，冷却后离心，于532nm测上清液吸光值。对照组以重蒸水代替海带多糖，去除率如“1.2.4〞计算。1.3统计学处理实验结果以(±s)表示，进行组间t检验，以p0.05为差别有显著性。2结果与分析2.1海带多糖对·oh的去除作用·oh是活性氧中活性最高且造成损伤最大的一种，它能够与生物体内的多种分子作用，造成糖类、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，造成细胞坏死或突变。羟自在基去除率是反映药物抗氧化作用的主要指标。本实验结果表示清楚，海带多糖对·oh有去除作用，且其去除率随海带多糖的剂量的增长而增大，呈一定的量效关系(表1)。表1海带多糖对·oh的去除作用2.2海带多糖对o-2的去除作用o-2是活性氧的一种，在体内由过氧化物歧化酶去除，假如体内过氧化物歧化酶活力下降或o-2产生过量都会给机体造成危害。本实验结果显示，海带多糖对o-2的去除作用与海带多糖的剂量呈一定的量效关系，当海带多糖的浓度为10.00mg/ml时，能够显著抑制o-2的产生(表2)。表2海带多糖对o-2的去除作用2.3海带多糖对小鼠红细胞溶血的影响h2o2为强氧化剂，能够毁坏红细胞膜而导致血红蛋白溢出出现溶血，本实验观察了海带多糖对h2o2诱导的红细胞氧化溶血的影响。结果显示，海带多糖对h2o2诱导的红细胞溶血具有明显的抑制效果(表3)。表3海带多糖对红细胞氧化溶血的影响2.4海带多糖对小鼠心、肝及肝线粒体脂质过氧化产品生成的影响mda为脂质过氧化产品，其生成的多少能够反映出组织细胞的受损水平，本实验测定了海带多糖对小鼠心、肝匀浆及肝线粒体中mda生成的影响。结果显示，海带多糖能够有效抑制小鼠心脏、肝脏组织匀浆及肝亚细胞脂质过氧化的发生，且mda的抑制率随海带多糖浓度的增长而提升(表4～6)。表4海带多糖对小鼠心mda生成的影响表5海带多糖对小鼠肝匀浆中mda生成的影响表6海带多糖对小鼠肝线粒体中mda生成的影响3讨论活性氧自在基(reactiveoxygenspecies，ros)包含h2o2、·oh、o-2等是在人体内新陈代谢的中间产品。一般来说，在人的正常新陈代谢中，ros的产生和去除坚持着动态平衡[8]。当机体内的诱导物诱导氧化能力跨越抗氧化物抗氧化能力时，就会引发细胞死亡并导致组织的损害。当前发现ros与人类多种疾病的发病机理相关，如癌症、衰老和动脉慢性病[9]。因而，医药领域一直在不断探寻求索和利用抗氧化物质来去除ros来阻拦氧化损害，而天然的抗氧化物质具有低毒的特点，一直是学者研究的热门。本实验研究表示清楚,海带多糖体外可去除o-2及·oh，抵抗小鼠红细胞的氧化性溶血，抑制小鼠心、肝及肝线粒体中mda的生成，具有去除自在基及抗脂质过氧化的作用,是一种天然抗氧化剂。我们国家海域辽阔，海带资源特别丰富，收集和养殖工艺简单。本试验对于海带多糖的研究、开发、利用提供了实验根据。【以下为参考文献】[1]邓长江,朱希强,郭学平.海带多糖药理作用的研究进展[j].食品与药品,2006,8(4):30-32.[2]梁桂宁,谢露,胡世凤，等.海带多糖对应激小鼠肾组织抗氧化能力的影响[j].现代医药卫生,2006,(18):2783-2784.[3]高梦祥,叶森.海带多糖的提取工艺研究[j].长江大学学报:天然科学版,2005,2(5):73-76.[4]smirnoffn,cumbesq.hydroxylradicalscavengingactivityofcompatiblesolutes[j].phytochemistry,1989,28(4):1057-1060.[5]王书芳,王勤,潘静.吡咯啉氮氧自在基及衍生物抗大鼠不同组织脂质过氧化损伤[j].中国药理学通报,2001,17(4):424-427.[6]田京伟,杨建.白藜醇苷体外抗氧化活性[j].中草药,2001,32(10):978-980.[7]曹炜,尉亚辉,杨建雄.蜂胶对氧自在基和四氧嘧啶致小鼠肝脏损伤的保卫作用[j].中药材,2001,32(11):1013-1015.[8]p