物理图绘制市公开课获奖课件

第三章物理图绘制学习要点：物理作图办法各种办法优缺点第1页第1页用遗传学技术作图对于指导基因组计划测序阶段还是远远不够，由于遗传图谱不足：遗传图分辨率有限：依赖于所得到互换数目。遗传图准确性较低：重组热点存在。遗传图准确率有限：环境原因和取样误差，分子标识排列有时会出现差错。第2页第2页物理图谱是以物理距离来表示各遗传标识之间或DNA序列两点之间在DNA分子上位置，以实际碱基对长度来度量其物理距离。第3页第3页1）限制性作图（Restrictionmapping）：它是将限制性酶切位点标定在DNA分子相对位置。2）依托克隆基因组作图

(Clone-basedmapping)：依据克隆DNA片段之间重叠顺序构建重叠群

(Contig),绘制物理连锁图。3）荧光原位杂交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）：将荧光标识探针与染色体杂交拟定分子标识所在位置。4）序列标识位点作图

（Sequencetaggedsite,STS）：通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因组DNA区段中。物理图绘制办法第4页第4页3.1限制性作图第5页第5页3.1.1限制性作图---小分子DNA第6页第6页在连续出现2个或多个相同酶切位点区段，其排列序列可有各种选择，此时采用部分酶切办法使该区段只发生一次酶切，这称为部分限制作图。第7页第7页第8页第8页部分限制作图为构建完整图谱提供了必须信息。但假如有多个限制位点，这种办法就显得力不从心。尤其是内部含有大小相同片段时，重叠片段无法区别，使排序变得非常复杂。一个较简朴变通策略使我们能够忽略大量片段。这种办法是将标识物加到要分析DNA分子两端，进行部分酶切处理后，诸多产物成为不可见，我们利用可见部分大小，拟定那些未定位切点与DNA分子末端相对位置。第9页第9页第10页第10页1)制备---琼脂糖包埋法2)酶切---稀有酶切位点限制酶3)分离---脉冲电泳分离3.1.2限制性作图局限假如基因组较大，切点较多，单、双、部分酶切片段会诸多。限制性作图只能应用于较小DNA分子。大分子DNA研究策略与办法：第11页第11页

1.制备--琼脂糖包埋法1)分离纯化细胞核；2)将搜集细胞核包埋在琼脂糖凝胶薄片中；3)蛋白酶消化处理细胞核。第12页第12页2.稀有切点限制性内切酶应用1)稀有切点限制酶：在基因组DNA序列中只有很少可辨认序列限制酶，普通辨认位点在6-8碱基对之间,并含有高G/C比。2)选取稀有切点限制酶注意事项：a)辨认位点非特异序列，-GANTC-(HinfI)，-GCCN4NGCC-(BglI)b)高等生物基因组普通A/T比较高，应选G/C高百分比限制酶，如-GCGGCCGC-(NotI)c)基因组甲基化状态，人类基因组DNA中5’-CG-3’序列较少。第13页第13页稀有切点限制酶第14页第14页常规与非常规琼脂糖凝胶电泳正交变电场凝胶电泳3.脉冲凝胶电泳第15页第15页均一脉冲电泳第16页第16页3.2基于克隆基因组作图

---大分子DNA克隆基于克隆基因组作图：依据克隆DNA片段之间重叠序列构建重叠群(Contig)，绘制物理连锁图。第17页第17页3.2.1克隆作图载体和办法常规质粒载体不适合用于大分子DNA克隆。大分子DNA克隆载体构建:YAC,BAC,HAC,MAC第18页第18页酵

母

人

工

染

色

体（YAC）端粒：用于保护线状DNA不被细胞内核酸酶降解，以形成稳定结构。着丝粒：有丝分裂过程中纺锤丝结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分派到子细胞中。在YAC中起到确保一个细胞内只有一个人工染色体作用。自主复制序列：一段特殊序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须信号。第19页第19页YAC文库装载DNA片段大小普通可达200-500kb，有可达1Mb以上。

YAC载体工作原理第20页第20页YAC主要缺点：

1．存在高百分比嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连独立片段；

2．部分克隆子不稳定，在转代培养中也许会发生缺失或重排；

3．难与酵母染色体区别开，由于YAC与酵母染色体含有相同结构;

4．转化效率低。

第21页第21页细菌人工染色体（BAC）：以细菌F因子为基础，人工构建环状DNA分子。能够携带不小于100-350Kb外源DNA片段。选择标识：氯霉素抗性基因等。BAC载体长处：较为稳定；没有嵌合现象；转化效率高；BAC克隆易于操作和DNA提取；BAC文库筛选以便。第22页第22页基因组文库：指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生基因组DNA片段随机同相应载体重组、克隆，所产生克隆群体代表了某种有机体整个基因组。1)目的基因组大分子DNA制备；2)载体制备；3)载体和DNA连接；4)转化；5)转化子鉴定。YAC和BAC基因组文库构建第23页第23页

目的基因组大分子DNA制备样品→洗涤吸干水分→液氮冷冻→碾碎→离心搜集细胞核→低融点琼脂糖包埋→蛋白酶消化→洗涤→限制酶部分酶解第24页第24页插入大分子DNA分离第25页第25页载体制备与插入DNA连接1)YAC载体：制备过程与普通质粒载体相同。2)BAC载体：低拷贝载体，大量制备，超离心纯化。3)酶切：释放接头，接头去磷，减少自连。4)连接：将含有大分子DNA琼脂糖薄片与载体混合,按重量比1:1，680C保温5min，降温至370C，加入连接酶过夜。第26页第26页思考题：如何从单条染色体中制备出DNA克隆文库？第27页第27页染色体步移3.2.2重叠群组建互相重叠DNA片段构成物理图称为重叠群(contig)。构建重叠群：步移法和指纹法第28页第28页

3.2.3指纹作图—3种指纹在基因组范围内查找重叠克隆，最好办法是克隆指纹排序。指纹指克隆DNA序列所含有特定DNA片段构成。第29页第29页限

制

性

片

段

指

纹

作

图

原

理第30页第30页限制性片段指纹电泳图第31页第31页指纹重叠群构建第32页第32页酵母基因组遗传图与物理图整合第33页第33页3.3染色体细胞图细胞图：通过原位杂交办法将基因或DNA分子标识定位在染色体某一区段，由此绘制图称为细胞图。最惯用细胞图绘制技术为荧光原位杂交。（fluorescentinsituhybridization,FISH）原位杂交是以标识DNA分子为探针，检测完整染色体一个杂交分析办法，其必须使染色体DNA成为单链。第34页第34页荧光原位杂交第35页第35页一个封闭杂交探针中重复序列办法第36页第36页限制性作图不能用于大型基因组；克隆重叠群复杂，费时费力；FISH难于操作，数据积累慢。目前最有效物理作图技术，也是能对大型基因组产生最详尽图谱技术，是STS作图，主要为辐射杂种作图。3.4序列标签位点

（Sequencetaggedsite,STS）作图第37页第37页STS是一段短DNA序列，其长度通常为100—500bp。一段DNA序列要成为STS需满足两个条件：1.它序列必须是已知，便于PCR检测；2.STS必须在拟研究染色体上有唯一定位。第38页第38页寻找STS办法1）从EST序列中寻找2）SSLP3）随机基因组序列第39页第39页1.STS在染色体上位置是确定。2.两个不同STS出现在同一片段机会取决于它们在基因组中位置，彼此靠近，同时出现在同一片段机会就大，反之则小。

辐射杂种作图原理第40页第40页STS作图与连锁分析是一样，不同之处仅在于两个标识间图距是依据分离频率来计算。主要采取方法是辐射杂种作图。第41页第41页辐射杂种（放射杂交体）：指含有另一个生物染色体片段啮齿类细胞。辐射杂种作图程序与办法第42页第42页辐射杂种群PCR检测STS标识，依据成对STS出现频率，判断标识是否连锁及连锁程度第43页第43页辐射杂种图距单位

辐射杂种作图单位为厘镭(centiRay,cR)：DNA分子暴露在N拉徳(rad)X射线剂量下两个分子标识之间发生1%断裂机率。利用类似于遗传重组原理和最大似然性统计学办法来计算存在于DNA片段上STS之间断点频率，以此预计标识之间距离。《StatisticalMethodsforMultipointRadiationHybridMapping》第44页第44页人类21号染色体辐射杂种图第45页第45页人类21号染色体辐射杂种物理图第46页第46页人类基因组物理图谱:人类基因组序列开始测定期，已有45万个EST，其中有一些重复序列，经计算机分析筛选后得到49625个。再从中筛选出3万个EST、2个辐射杂交系库（分别有83和93个细胞株）、1个有3个克隆YAC文库，用于构建物理图谱。构建物理图谱密度为每个标识183Kb。EST分布结果表明，基因在染色体上排列是不均匀。将物理图谱和遗传图谱整合而成愈加完整人类基因组图谱，作为基因组测序框架和分析依据。第47页第47页第48页第48页讨论：遗传图谱和物理图谱哪一个愈加有用？第49页第49页图谱应用---定位克隆（图位克隆）定位克隆（positionalcloning）：利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体特定区带并对目的基因进行克隆。定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁遗传标识在染色体上位置。克隆：从定位染色体区段内分离克隆所要基因，并进一步研究其功效。第50页第50页第51页第51页定位克隆主要目的之一是将目的基因定位于特定染色体上。A-1型短指（趾）症：法拉比（Farabee）19在他哈佛大学医学院博士毕业论文中首先报道了这一病症，即世界上第一例孟德尔常染色体显性遗传病，以后作为遗传学典型例子被全世界生物学和遗传学教材广泛引用。第52页第52页贺林等利用布依族、苗族和汉族三个A-1型短指（趾）症大家系，对该病致病基因进行了准拟定位（位点定在2q35-36区）、克隆，并初次发觉了人IHH基因和该基因上三个突变位点是造成A-1型短指（趾）症直接原因。第53页第53页番茄抗病基因图位克隆第54页第54页定位候选克隆该办法是定位克隆进一步发展。将疾病相关基因定位于染色体相关区域；该染色体区域得到若干候选基因；进一步分析得到目的cDNA；蛋白质功效研究。疾病染色体定位若干候选基因拟定目基因蛋白质功效第55页第55页功效克隆克隆（致病）基因另一个策略。搜集所要克隆基因蛋白质产物及其功效信息，用以分离基因，并对基因进行定位。性状（疾病）蛋白质产物（生物学功效）从氨基酸序列出发设计DNA引物，从文库调取基因得到基因序列染色体定位疾病功效基因第56页第56页分析异常基因产物（蛋白质），弄清它是如何引起临床症状：纯化蛋白质，进行氨基酸序列测定，据此推测也许核苷酸序列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA文库或基因组文库中筛选对应编码基因；绝大部分分子病、遗传性代谢缺点病如白化病（albinism）、苯丙酮尿症（PKU）和镰刀形细胞贫血病（sickle-celldisease）等，都是采取这一策略。第57页第57页流式细胞仪计数仪荧光染料对染色体染色。荧光探测器拟定含有正确染色体液滴发出信号，并将一个电荷加到液滴上第58页第58页Science：发觉新抑癌基因SDH5郝淮湘博士从一个功效未知蛋白入手，发觉了一个疾病基因并阐明了其分子功效和致病机理。

SDH5,aGeneRequiredforFlavinationofSuccinateDehydrogenase,IsMutatedinParagangliomaHuai-XiangHao1,OlehKhalimonchuk2,MargitSchraders3,NoahDephoure4,Jean-PierreBayley5,HenricusKunst6,PeterDevilee7,CorW.R.J.Cremers6,JoshuaD.Schiffman8,BrandonG.Bentz9,StevenP.Gygi4,DennisR.Winge2,HannieKremer3,JaredRutter1*第59页第59页郝淮湘，一位在美国诺华生物医学研究所接受博后训练80后大男孩，在《Science》上发表了一篇美丽研究性文章，文章被同期Nature杂志推荐为亮点研究结果。郝淮湘1999－在厦门大学生命科学学院生物科学专业就读，最后一年在长江学者林圣彩专家试验室完毕了本科毕业论文。8月来到美国犹他州盐湖城犹他大学就读，第二年加入医学院生物化学系JaredRutter专家试验室，在其指导下进行博士论文研究，年5月答辩。年6月至今，在波士顿剑桥诺华生物医学研究所（NovartisInstitutesforBioMedicalResearch）进行博士后训练。第60页第60页生物通：作为一名80后年轻人，您能够说十分年轻，就已经取得生命科学领域博士学位，能谈谈您出国求学成长历程吗？能够给我们青年读者简介一下在美国学习感受吗？郝淮湘：其实我拿到博士学位并不算早，花了快要六年（－），有些人四年多就博士毕业了。来美国后第一年主要是上课和在四个试验室轮转（能够从快要100个试验室选择）。这边上课没有教科书，一门课多个专家讲课，诸多时候都是直接讲文献，一个部分上完就考一次试，记忆东西不多，主要是分析能力。第二年时候，我依据自己兴趣和对导师和课题判断加入了一个新成立试验室，跟年轻导师做研究即使会辛劳一点，但是确实能学诸多东西，也有机会理解如何建立试验室和从头构思课题。在此后5年里，我接触了多个研究项目，一些失败了，最后有