修复和转座分子生物学

修复和转座分子生物学第1页/共67页DNA变异的三个主要来源：DNA复制不准确性外界环境或内部因素对遗传物质的损伤转座子（transposon

）元件的插入造成2.5.1

DNA变异或损伤的来源

牛牛文库文档分享第2页/共67页（1）DNA复制不准确性

DNA复制是严格而精确的事件，但也可能发生错误。虽然有碱基互补配对和pol的校正作用，但错配率仍有10-10

左右。

牛牛文库文档分享第3页/共67页染色体上有些位点是热点，复制错误率高Thesemutation-pronesequencesare

repeatsofsimpledi-,tri-ortetranucleotidesequences,whichareknownasDNAmicrosatellites.Onewell-knownexampleinvolvesrepeatsofthedinucleotidesequenceCA.StretchesofCArepeatsarefoundatmanywidelyscatteredsitesinthechromosomesofhumansandsomeothereukaryotes.

牛牛文库文档分享第4页/共67页MutationsarisenotonlyfromerrorsinreplicationbutalsofromdamagetotheDNA.Somedamageiscaused,asweshallsee,byenvironmentalfactors,suchasradiationandso-calledmutagens（诱变剂）,whicharechemicalagentsthatincreasetherateofmutationButDNAalsoundergoesspontaneousdamagedependsonanaqueousenvironment（2）外界环境或内部因素对DNA的损伤

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①电离辐射

Ionizing（x-andγ-rays）andnonionizing（UV）radiationproduceavarietyofDNAlesions.

受到紫外线照射时，DNA链上相邻的嘧啶以共价键连接形成二聚体。

牛牛文库文档分享第6页/共67页环丁烷环

牛牛文库文档分享第7页/共67页②化学因素

烷化剂：硫酸二甲酯，甲烷磺酸甲酯等使碱基烷化，导致复制时碱基错配。

牛牛文库文档分享第8页/共67页如鸟嘌呤Ｎ７被烷化后，与Ｔ配对，使Ｇ－Ｃ转变为Ａ－Ｔ。

牛牛文库文档分享第9页/共67页硝酸盐：亚硝酸盐能使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T对。

牛牛文库文档分享第10页/共67页DNAisalsosubjecttoattackfromreactiveoxygenspecies(forexample,O2-.H2O2,andOH·).

活性氧的攻击烷化去氨基氧化

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碱基类似物：如５－溴尿嘧啶（5-BU），５-氟尿嘧啶(5-FU)等，它们的结构与碱基相似，进入细胞能代替正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA的复制。

牛牛文库文档分享第12页/共67页5-BU与T结构相似，在酮式时，与A配对；它呈烯醇式结构，与G配对。在复制时导致A-T转换为G-C酮式烯醇式

牛牛文库文档分享第13页/共67页嵌入试剂可以导致一个甚至几个碱基对的插入或缺失原黄素

牛牛文库文档分享第14页/共67页TheAmestest（艾姆斯氏试验）

(检查化学物质潜在的致癌作用，可以从其诱变能力方便的估计)

牛牛文库文档分享第15页/共67页③碱基自发改变造成的损伤碱基的互构异变，会使碱基间发生错配，使A-C,G-T。DNA的水解或脱-NH2：碱基环外的-NH2有时会发生自行脱落，使C→U,A→I(次黄嘌呤），G→X(黄嘌呤）；复制时U-A，I-C，I-X配对，导致子代DNA序列错误.

牛牛文库文档分享第16页/共67页最常见和最重要的水解损伤是胞嘧啶的脱氨基。

牛牛文库文档分享第17页/共67页脱氨基作用使腺嘌呤转变为次黄嘌呤（hypoxanthine，I）,whichhydrogenbondstocytosineratherthantothymine;鸟嘌呤转变为黄嘌呤(xanthine),whichcontinuestopairwithcytosine,thoughwithonlytwohydrogenbonds.

牛牛文库文档分享第18页/共67页DNA也会自发水解C-N糖苷键而发生脱嘌呤作用（depurination）,在DNA分子中产生无碱基位点。

牛牛文库文档分享第19页/共67页DNA

复制错误和DNA损伤会导致以下两种结果：Somekindsofdamage,suchasthyminedimersornicksandbreaksintheDNAbackbone,preventitsuseasatemplateforreplicationandtranscription.Otherkindsofdamagecreatealteredbasesthathavenoimmediatestructuralconsequenceonreplicationbutcausemispairing;thesecanresultinapermanentalterationtotheDNAsequenceafterreplication.

牛牛文库文档分享第20页/共67页Thetwochallengeforthecell:First,itmustscanthegenometodetecterrorsinsynthesisanddamagetotheDNA.Second,itmustrepairthelesionsanddosoinawaythat,ifpossible,restorestheoriginalDNAsequence.

牛牛文库文档分享第21页/共67页2.5.2

ＤＮＡ复制错误及损伤修复

细胞有一套用来检验错配并对之进行修复的机制。DNA修复系统功能错配修复恢复错配切除修复（碱基、核苷酸）切除突变的碱基和核苷酸片段重组修复复制后的修复，重新启动停滞的复制叉DNA直接修复修复嘧啶二体或甲基化DNASOS系统DNA的修复，导致变异存在于E.Coli中的DNA修复系统

牛牛文库文档分享第22页/共67页Themismatchrepairsystemfacestwochallenges：First,itmustscanthegenomeformismatches.Becausemismatchesaretransient(theyareeliminatedfollowingasecondroundofreplicationwhentheyresultinmutations),themismatchrepairsystemmustrapidlyfindandrepairmismatches.Second,thesystemmustcorrectthemismatchaccurately;thatis.itmustreplacethe

misincorporatednucleotideinthenewlysynthesizedstrandandnotthecorrectnucleotideintheparentalstrand.保证DNA复制高保真的最后责任由错配修复系统承担。

错配修复

牛牛文库文档分享第23页/共67页错配由错配修复蛋白MutS的二聚体来检测，从错配引起ＤＮＡ骨架的扭曲变形上识别。错配修复更正新引入的错配碱基。helicaseUvrD.错配修复能将逃脱校正阅览的错误去除

牛牛文库文档分享第24页/共67页系统识别母链的依据来自Dam甲基化酶，它能使位于5‘-GATC序列中A的N6位甲基化。A的甲基化是错配修复系统的识别标志。

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牛牛文库文档分享第26页/共67页eukaryoteshavemultipleMutS-likeproteins(MSH)withdifferentspecificities.Forexample,oneisspecificforsimplemismatches,whereasanotherrecognizessmallinsertionsordeletionsresulting"slippage"duringDNAreplication.

牛牛文库文档分享第27页/共67页最近研究表明，MutS类似物(MSH)与复制体上的滑动夹元件（PCNA）相互作用，因此可被引到后滞链DNA不连续合成的部位上。与滑动夹的相互作用也可能将错配修复蛋白引到前导链的3‘(生长中)端。

牛牛文库文档分享第28页/共67页DNA损伤的直接逆转Anexampleofrepairbysimplereversalofdamageisphotoreactivation光复活作用.Inphotoreactivation,theenzymeDNAphotolyase光裂解酶

capturesenergyfromlightandusesittobreakthecovalentbondslinkingadjacentpyrimidines.

牛牛文库文档分享第29页/共67页AnotherexampleofdirectreversalistheremovalofthemethylgroupfromthemethylatedbaseO6-methylguanineamethyltransferase(甲基化转移酶)removesthemethylgroupfromtheguanineresiduebytransferringittooneofitsowncysteineresidues(半胱氨酸残基)。Thisrepairprocessisexpensive,theenzymeseemstobeirreversibleinactivated,sowecallita“suicideenzyme”todenotethefactthatit“dies”inperformingitsfunction.

牛牛文库文档分享第30页/共67页Excisionrepairsystem切除修复系统

碱基切除修复系统核苷酸切除修复系统

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碱基切除修复系统

识别受损核酸位点的糖苷水解酶，能特异性切除受损核苷酸上的N-β-糖苷键，在DNA链上形成AP位点；AP核酸内切酶切开受损核苷酸的糖苷-磷酸键，移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA；一类DNA糖苷水解酶只对应于某一特定类型的损伤。

牛牛文库文档分享第32页/共67页糖苷水解酶

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核苷酸切除修复系统

当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则由此系统负责修复。Unlikebaseexcisionrepair,thenucleotideexcisionrepairenzymesdonotrecognizeanyparticularlesion.Rather,thissystemworksbyrecognizingdistortions（扭曲，变形）totheshapeofthedoublehelix,suchasthosecausedbyathyminedimerorbythepresenceofabulkychemicaladductonabase.NucleotideExcisionRepairEnzymesCleaveDamagedDNAonEitherSideoftheLesion

牛牛文库文档分享第34页/共67页8bases4-5basesFourproteinsUvrA,UvrB,UvrCandUvrDarerequiredinthisprocess.UvrAisresponsiblefordetectingthedistortionofthedoublehelix.

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RecombinationRepairssystem

重组修复系统切除修复用未受损的DNA链作为模板，合成相应的DNA以代替另一条链上已受损的DNA片段。未受损的DNA链为受损链的恢复提供了正确的遗传信息。如果DNA双螺旋的两条链都受损，DNA如何恢复正常?由双链断裂修复途径（Double-strandbreak（DSB）repairpathway）进行。从姐妹染色体中取回正确的遗传信息,又称同源重组修复。

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牛牛文库文档分享第37页/共67页SOS反应SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-pronerepair），使细胞有较高的突变率。

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SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的紧急效应。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复系统（如错配修复、直接修复、切除修复）和易产生差错的修复系统酶，包括修复酶，对DNA的辐射或其它损伤反应;SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。

牛牛文库文档分享第39页/共67页有一种异常的重组类型，是一段DNA序列插入到另一段DNA序列中，而不依赖于序列同源性。这种使某些元件从一个位置向其他位置的移动方式是转座(transposition)。转座中涉及的机制依赖于DNA链的切割和重接，因此与重组过程联系起来。转座重组会破坏染色体上基因的排列顺序。2.6DNA的转座

牛牛文库文档分享第40页/共67页一种可以由染色体的一个位置转移到另一位置的遗传因子，也就是一段可以发生转座(transposition)的DNA，又称为转座子(transposon)。转座子可反复插入到基因组中的许多位点,可以从基因组的一个位点转移到另一个位点，从一个复制子转移到另一个复制子。2.6.1转座子概念

牛牛文库文档分享第41页/共67页2.6.2转座子的发现20世纪40年代，美国遗传学家McClintockB在研究玉米的遗传因子时发现，某些基因活性受到一些能在不同染色体间转移的控制因子（controllingelement）所决定。这一发现与当时传统的遗传学观点相抵触，因而不被学术界所普遍接受。

牛牛文库文档分享第42页/共67页60年代后期，美国青年细菌学家ShapiroJ在大肠杆菌中发现一种由插入序列所引起的多效突变，之后又在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子，才重新引起人们重视。1983年McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖，距离她公布玉米控制因子的时间已有32年之久。

牛牛文库文档分享第43页/共67页所有生物的基因组中均有转座子。基因组序列的比较分析发现：First,transposon-relatedsequencescanmakeuphugefractionsofthegenomeofanorganism.Forexample,morethan50%ofboththehumanandmaizegenomesarecomposedoftransposon－relatedDNAsequence.Second,thetransposoncontentindifferentgenomesishighlyvariable.

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牛牛文库文档分享第45页/共67页2.6.3转座子的特点转座子是不必借助同源序列就可以移动的片断,即转座作用与供体和受体的序列无关;原核生物和真核生物都有转座子;转座序列可沿染色体移动,甚至在不同染色体间跳跃(跳跃基因)

牛牛文库文档分享第46页/共67页转座的位置通常或多或少是随机的。当转座子插入一个基因内时，该基因失活，如果是重要的基因就可能导致细胞死亡。因此转座必须受到控制，并且频率都很低。转座子对基因组而言是一个不稳定因素，它可导致宿主序列删除、倒位或易位，并且其在基因组中成为“可移动的同源区”。位于不同位点的两个拷贝转座子之间可以发生交互重组，从而造成基因组不同形式的重排。有些转座子与基因组的关系犹如寄生，它们的功能只是为了自身的扩增与繁衍，因此被称为是自私的DNA。selfishDNA

牛牛文库文档分享第47页/共67页2.6.4转座子的分类和结构特征插入序列（insertionalsequence,IS）

123456789转座酶、调控蛋白987654321是简单的转座子，除转座所需基因外不携带任何标记基因，它的存在只能借助插入位点有关基因的失活来判断，或者通过分子杂交和测序来检测。

插入序列是最小的转座因子。所有插入序列的两端都有反向重复(invertedrepeats)。反向重复为转座酶识别所需，通常重复序列长度为15-25bp。重复序列有时只是相似，并非相同。

牛牛文库文档分享第48页/共67页（1）含短的末端反向重复序列;（2）含编码转座酶的基因;（3）靶位点存在5-9bp的短正向重复序列。插入序列的结构特征

牛牛文库文档分享第49页/共67页转座子除编码转座功能有关的基因外，还携带抗性或其他标记基因。转座子按其结构又分为两类：一类是组合因子（compositeelement）,由个别模件组合而成，通常包括两个插入序列作为两臂，中间为标记基因。另一类为复合因子（complexelement）,含有转座酶基因、解离酶(resolvase)基因以及标记基因，两端为反向重复，无插入序列。2.复合型转座子（compositetransposon）

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牛牛文库文档分享第51页/共67页2.6.5真核生物的转座子原核与真核生物转座因子的异同点：相同点：转座依赖于转座酶，转座因子的两端有被转座酶识别的反向重复序列，转座的靶位点是随机的，靶位点交错切开，插入转座因子后经修复形成两侧正向重复序列。

牛牛文库文档分享第52页/共67页不同点：原核生物的转录和翻译几乎是同时进行的，真核生物由于核结构的存在而使此两过程在空间上和时间上都被分隔开了。因此，真核生物细胞内只要存在转座酶，任何序列片段具有该酶识别的反向重复末端均可发生转移，而无需由被转移序列自身编码这些酶。真核生物的转座因子家族中只保留少数拷贝具有编码转座酶基因的活性，而多数拷贝中发生程度不同的删除，失去转座酶基因活性，但保留了两端的反向重复序列。原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座子，表现出顺式显性（cisdominance）,真核生物则无此特性，这也是二者最明显的差别。

牛牛文库文档分享第53页/共67页玉米细胞内的转座子：自主性转座子，非自主性转座子Ac-Ds系统：激活-解离系统非复制型机制转座右边示Ac及Ds元件的单链DNA末端反向重复配对所形成的茎环结构，这种结构可能对转座有意义

牛牛文库文档分享第54页/共67页2.6.6转座作用的机制复制型：复制粘贴非复制型：剪切粘贴

牛牛文库文档分享第55页/共67页2.6.7

转座的遗传效应和意义１．转座的遗传效应①转座引起插入突变转座插入基因后，使基因突变失活；当转座因子自发插入细菌的操纵子时，可阻止它所在基因的转录和翻译。

牛牛文库文档分享第56页/共67页②转座产生新的基因转座子带有抗性基因，如抗药性基因ampC,可产生两方面的效应：插入突变，出现抗药基因。

牛牛文库文档分享第57页/共67页③转座引起染色体畸变在一个染色体或者不同的染色体上如果有同一个转座子的2个拷贝，通过某种方式的重组后造成染色体断裂、缺失、倒位及易位等，使基因突变和重排的重要原因。

牛牛文库文档分享第58页/共67页④转座引起生物进化使原来相距甚远的基因组合在一起，构建成一个操纵子或表达单元，可能产生新的生物学功能的基因和新的蛋白。

牛牛文库文档分享第59页/共67页２．转座的遗传效应的意义①可使原来距离较远的基因组合在一起形成一个操纵子；②启动子部位的插入使基因打开或关闭；③转座基因插入时，大多数受体基因被失活；但也有被活化的基因，转