细胞因子检测

关于细胞因子检测第一页，共二十七页，编辑于2023年，星期三细胞因子

一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。

白细胞介素(interleukin,IL)干扰素(interferon,IFN)肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)生长因子(growthfactor,GF)趋化因子(chemokine)第二页，共二十七页，编辑于2023年，星期三优点：敏感、可靠；缺点：需长期饲养细胞、检测耗时长、步骤繁杂。1不同的CK具有不同的生物学活性，选择CK独特的生物学活性，即可检测。细胞增殖/抑制实验细胞病变抑制实验细胞毒实验细胞趋化实验。。。生物学检测法细胞因子的检测方法2利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。。。免疫学检测法优点：方便、迅速缺点：价格昂贵，结果仅代表CK的量而非活性，敏感性较低。3利用基因探针，检测特定细胞因子基因表达，即mRNA水平。斑点杂交Northern印迹细胞和组织原位杂交RT-PCR。。。分子生物学检测法局限性：仅能检测基因表达情况，不能直接提供有关细胞因子的浓度和活性，只用于机制探讨。第三页，共二十七页，编辑于2023年，星期三待检样品(细胞上清)指示细胞（CTLL-2）IL-2依赖细胞系按不同稀释度加入37ºC，16-20小时加入3HTdR（1-5Ci）37ºC，4-6小时收集细胞测定细胞增殖实验第四页，共二十七页，编辑于2023年，星期三细胞病变抑制实验待检样品（细胞上清）IFN-指示细胞（wish）按不同稀释度加入37ºC，4小时37ºC，24-48小时弃取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒)观察细胞病变（镜检或比色）第五页，共二十七页，编辑于2023年，星期三UsingCFSEtotrackCMLprogenitorproliferationSDMSDM+Glivec第六页，共二十七页，编辑于2023年，星期三CalculationofProliferativeIndex(P.I.)CFSE--->43210TheProliferativeIndexisthesumofthecellsinallgenerationsdividedbythecalculatednumberoforiginalparentcells.Itisusefulforcomparingquantityofcelldivisionbetweenculturesofthesamecellsundergoingdifferenttreatments.第七页，共二十七页，编辑于2023年，星期三CellProliferationELISAKit,BrdU(colorimetric)第八页，共二十七页，编辑于2023年，星期三Chromium-51(51Cr)releaseassays

第九页，共二十七页，编辑于2023年，星期三计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化实验示意图微孔滤膜第十页，共二十七页，编辑于2023年，星期三

用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。免疫标记技术第十一页，共二十七页，编辑于2023年，星期三

高通量细胞因子检测CBA(CytometricBeadArray)是一种微珠多用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个数据。第十二页，共二十七页，编辑于2023年，星期三Cytokinenetwork第十三页，共二十七页，编辑于2023年，星期三第十四页，共二十七页，编辑于2023年，星期三第十五页，共二十七页，编辑于2023年，星期三CBA原理示意图第十六页，共二十七页，编辑于2023年，星期三第十七页，共二十七页，编辑于2023年，星期三LabInvest2003,83:1131–1146cytokinebeadarrays(CBA)第十八页，共二十七页，编辑于2023年，星期三ELISPOT(酶联免疫斑点实验)ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细胞因子。实验中每个斑点（spot）是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。可检测到百万分之一阳性细胞率;单细胞水平、活细胞功能检测;操作简便，可进行高通量筛选。第十九页，共二十七页，编辑于2023年，星期三1.特异性单抗包被在培养板孔底部；2.封闭能结合单抗的其他部位；3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞分泌的细胞因子被单抗捕获；4.移出细胞，洗涤；5.加入生物素标记的二抗；6.加入酶标链霉亲和素；7.加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；8.斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，结果分析。ELISPOT第二十页，共二十七页，编辑于2023年，星期三第二十一页，共二十七页，编辑于2023年，星期三应用移植研究--allograftrejection疫苗开发--亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响Th0/Th1/Th2细胞转换分析自体免疫研究--免疫调节及免疫治疗研究癌症研究--肿瘤反应T细胞作用过敏机制探讨--IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞因子的研究传染疾病研究--Lymedisease,Chlamydiainfections,Helicobacterpyloriinfections,HIVinfections,multiplesclerosis,等第二十二页，共二十七页，编辑于2023年，星期三MediumPHAPeptide1Peptide21Peptide47GzBHIV-peptiderecallpatientBIFN-gHIV-peptidespecificrecallresponseshowsdissociatedproductionofIFN-gandGzBKleenT.etal,AIDS2003,18:383-392第二十三页，共二十七页，编辑于2023年，星期三ELISPOT和ELISA的区别ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展，它们最大的不同:

1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量(整体水平);ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（单细胞水平）；

2.ELISPOT比ELISA更敏感。ELISPOT技术应用领域：自身免疫诊断和预后分析、器官移植后排斥反应的预测、过敏性疾病脱敏治疗的监测、疫苗和药品的研发与检测等。第二十四页，共二十七页，编辑于2023年，星期三胞内细胞因子的检测LPS活化单核细胞内TNF-α的测定

R1：淋巴细胞；R2：单核细胞第二十五页，共二十七页，编辑于2023年，星期三TNF-的诱生和检测主要由单核/巨噬细胞及其他多种细胞产生，能使杀伤肿瘤细胞;THP-1(人单核细胞系)在LPS(脂