2014年研究生实验6聚丙烯酰胺电泳层析

实验五不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳第一页，共21页。【要求】

熟悉血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的特点，了解操作过程和注意事项。

第二页，共21页。实验分组（每人做一管，每4人配一份胶）

认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）

封管

分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，每组总体积为10ml，灌胶高度为7~8cm）

封正丁醇3mm（注意避免冲击凝胶液面,约15min胶聚合）P138：第三页，共21页。浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为4ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空加样）

倒掉并用滤纸条吸干正丁醇后，灌浓缩胶

封正丁醇3mm（观察界面的形成，判断凝固时间）

安装电泳槽，加buffer（注意电流及电极的方向、不漏水、除气泡）第四页，共21页。

样品处理并加样（20ul）

电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时2mA/管，距底1cm时停止）

剥胶：

取下凝胶管，用带10cm长针头的注射器吸满蒸镏水。将针头小心插入胶柱与管壁之间，边注水，边旋转玻管，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出。

第五页，共21页。固定（时间5min）染色（时间2min）漂洗脱色至背景透亮第六页，共21页。注意事项1．Acr和Bis是神经毒剂，应避免与皮肤接触。Acr和Bis在低温下稳定，应放棕色瓶干燥低温（4℃）保存。30％单体交联剂应装棕色瓶中，可于冰箱（4℃）贮存1～2月。如pH值超出4.9～5.2，则表明该试剂已失效，失效液不能聚合。TEMED宜密封避光保存。制备凝胶用玻管要用洗液浸泡清洁，否则由于玻管不清洁，倒胶后在管壁会出气泡。制备分离胶和浓缩胶时，加入催化剂和加速剂混合后约在10～30分钟内聚合，应尽快注入玻管。如室温过高时，为防止过快聚合，可放置冰浴中操作。如果凝胶不聚合，通常是由于制备的试剂浓度不准确，或者凝胶混合液中漏加某一试剂，也可能是试剂不纯所致，应重新配制混合液。第七页，共21页。第八页，共21页。

二、电泳基本原理及相关知识

第九页，共21页。电泳的概念带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。广泛应用于生物大分子的分离和鉴定第十页，共21页。实验室中常用到的电泳方法（以介质分类）

纸电泳

醋酸纤维膜电泳

凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳

第十一页，共21页。电泳的基本原理利用物质的两个差异来分离物质电荷差异

电荷性质电荷数量分子差异

分子大小分子形状第十二页，共21页。电泳分离蛋白质的原理

蛋白质两性解离与等电点

溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数量

不同蛋白质分子大小和分子形状的差异

第十三页，共21页。电泳的影响因素

带电粒子的性质

电场强度

溶液的pH

溶液的离子强度

电渗现象

环境因素

第十四页，共21页。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

【原理】

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺通过化学催化或光催化聚合形成的三维空间的聚合物。它应用于电泳具有以下特点：①分子筛作用，样品分离效果好；②通过控制单体浓度或单体与交联剂的相对比例来调节凝胶的孔径，以分离不同大小的蛋白分子；③凝胶不带电荷，几乎无电渗作用；④化学稳定性高；⑤有弹性，机械强度好。第十五页，共21页。合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法

化学合成系统

过硫酸铵（AP）

四甲基乙二胺（TEMED）

光学合成系统

核黄素四甲基乙二胺（TEMED）第十六页，共21页。聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个不连续

聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应

凝胶孔径不同缓冲液pH不同缓冲液离子成分不同浓缩效应电荷效应分子筛效应第十七页，共21页。Gly-Pro-Cl-Gly-Pro-Cl-Cl-Cl-Cl-Pro-Pro-Pro-Gly-Gly-Gly-pH为8.9的电泳缓冲液（Tris-Gly）pH为6.7的浓缩胶pH为8.3的分离胶有效泳动率：MCl->MPro->MGly-6%胶3%胶第十八页，共21页。四、实验结果的分析

第十九页，共21页。相关理论表-1血清中各蛋白质的相关特性种类分子量(万）PI分布(%)清蛋白1-球蛋白2-球蛋白-球蛋白-球蛋白6.9